水稻空间诱变生物学效应及分子多态性的初探

论文摘要

本研究以搭载太空遨游1天的“神舟五号”和5天的“神舟六号”的早稻品种沪旱3号和沪旱7号种子为材料,研究空间诱变的分子多态性以及生物学效应。种子返回后在上海和海南连续进行繁种至SP4代,获得稳定的株系,株系间存在明显的变异。本研究立足于探索这些变异的分子基础,主要结果如下:1.搭载种子经过空间诱变,产生丰富的突变类型,包括株高的变化、生育期推迟与提前、芒的变化、粒型的变化以及叶片白化和黄化等具有明显变化的性状。经过4个世代种植,获得208个稳定的SP4株系。2.利用分子标记（SSR、InDel和AFLP）对突变体进行初步筛选,得到了大量的多态性片断,并对这些多态性片段进行回收、测序以及与公开的基因组数据进行序列对比分析,以此来寻找并初步确定这些突变位点的变异规律。结果表明,大部分突变为缺失和转换突变,占总变异位点的66.7%,而小部分为插入和颠换突变,占总变异位点的33.3%。在缺失碱基突变中,缺失碱基T＞A＞C＞G;在插入碱基突变中,插入碱基A=G=C＞T;在转换突变类型中,A/G（A变为G）转换占总转换数31.25%,G/A占25%,C/T占31.25%,T/C占12.5%,G/A+A/G＞T/C+C/T,即嘌呤之间的转换要多于嘧啶之间的转换;在颠换突变类型中,其中G/T占40%,T/A占20%,A/T占20%,T/G占20%,仅有G与T、A与T之间的颠换突变。数据结果还表明多态率大小顺序是AFLP＞SSR＞InDel＞EST-SSR,并且突变位点分布于基因内（上游启动子、外显子或内含子等区域）。在简单重复序列区域,大部分突变位点分布在串联重复序列的两端（3’或5’端）。3.选取在基因位点已发生突变的单株,并针对突变位点的基因设计特异性引物,在苗期、分蘖期和抽穗期分别对叶和根中的对应突变基因进行半定量RT-PCR分析。结果表明,在苗期阶段,376、385、730和740突变株系的根和叶中对应突变基因（Os02g10140、Os01g69070、Os02g46410和Os03g02710）的表达都表现出下调,而突变株系709的根中对应突变基因（Os02g54010）的表达量出现了明显的提高;在分蘖期阶段,除突变株系730出现轻微的下调,其它突变体的表达量都没有出现明显的变化;在抽穗期阶段,374、385和730突变体的对应突变基因（Os03g62910、Os01g69070和Os02g46410）表达出现明显的下调;其中,730突变体在苗期、分蘖期和抽穗期都出现表达量下调的趋势。4.利用近红外光谱仪（VECTER 22/N）测定突变体与正常未处理的种子中的直链淀粉和蛋白质含量。结果表明,在直链淀粉含量测定中,与对照品种相比,335突变体出现显著提高,而369、360、374、385和707等突变体出现显著下降（P＜0.05）:在蛋白质含量测定中,371、376、730、709和716等突变体出现显著提高,而347、731、707和708等突变体出现显著下降（P＜0.05）。其中,707突变体的直链淀粉和蛋白质含量都表现出明显的下降（P＜0.05）。5.部分突变体的抗旱性初步分析。在水稻开始抽穗进入水分敏感时期进行抗旱性鉴定,发现与抗旱相关的突变株系材料10份,以及与旱敏感相关的突变体材料10份。并对部分旱敏感的材料349、371、376和392进行AFLP标记初步筛选,获得多个与旱敏感相关的多态性片断,为进一步寻找抗旱相关基因作准备。通过以上实验数据初步表明,太空诱变因素能够诱导水稻基因组中的DNA序列发生变异,并引起植物形态性状和代谢产物的变化,说明太空诱导变异为育种服务是可行的,并可以采用各种不同的分子生物学手段了解水稻太空育种的机制,为水稻种质资源创新和品种选育提供重要的理论指导。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 空间诱变因素对生物体的影响
• 1.1.1 空间辐射因素对生物体的影响
• 1.1.2 空间微重力效应对生物体的影响
• 1.1.3 其他诱变因素的复合效应
• 1.1.4 转座子活化效应对生物体的影响
• 1.2 分子标记在空间诱变中的利用
• 1.2.1 RAPD标记在空间诱变中的利用
• 1.2.2 SSR标记在空间诱变中的利用
• 1.2.3 AFLP标记在空间诱变中的利用
• 1.2.4 Microchip在空间诱变中的利用
• 1.3 空间诱变的生物学效应
• 1.3.1 空间诱变对植物形态学性状的影响
• 1.3.2 空间诱变的细胞学效应
• 1.3.2.1 空间诱变对细胞结构的改变
• 1.3.2.2 空间诱变导致细胞分化程度改变
• 1.3.2.3 空间诱变引起染色体畸变
• 1.3.3 空间诱变对植物生理生化特性的影响
• 1.4 航天诱变育种的现状
• 1.4.1 航天诱变育种的国外研究现状
• 1.4.2 航天诱变育种的国内研究现状
• 1.5 航天诱变育种的问题与展望
• 1.5.1 航天诱变育种的问题
• 1.5.2 航天诱变育种的展望
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 细菌培养基
• 2.1.3 感受态细胞制备、蓝白斑筛选。
• 2.1.4 抗生素、菌株以及克隆载体
• 2.1.5 酶、其他试剂以及引物合成
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SSR以及InDel标记的初步筛选
• 2.2.2 AFLP标记的初步筛选
• 2.2.2.1 酶切
• 2.2.2.2 连接
• 2.2.2.3 预扩增
• 2.2.2.4 选择性扩增
• 2.2.3 多态性片段的回收与分析
• 2.2.4 突变株系的RT-PCR分析
• 2.2.5 突变体种子的直链淀粉和蛋白质含量测定
• 2.2.6 突变株系的抗旱性
• 3 结果与分析
• 3.1 突变体主要农艺性状表现
• 3.1.1 空间诱变处理对突变体生育期的影响
• 3.1.2 空间诱变处理对突变体株高的影响
• 3.1.3 空间诱变处理对突变体叶型的影响
• 3.1.4 空间诱变处理对突变体穗型的影响
• 3.2 突变体的分子检测
• 3.2.1 SSR和InDel标记的多态率
• 3.2.2 突变株系的突变方式
• 3.2.3 突变体的突变序列分析
• 3.2.4 突变位点的功能预测
• 3.2.5 突变体的AFLP标记筛选
• 3.3 突变体突变基因在各个时期的表达分析
• 3.3.1 苗期突变株系的表达分析
• 3.3.2 分蘖期突变株系的表达分析
• 3.3.3 抽穗期突变株系的表达分析
• 3.4 突变体代谢产物分析
• 3.4.1 突变体种子直链淀粉含量分析
• 3.4.2 突变体种子蛋白质含量分析
• 3.5 突变株系抗旱性初步分析
• 4 讨论
• 4.1 空间诱变的农艺性状分析
• 4.2 空间诱变的多态性分析
• 4.3 空间诱变的突变位点的结构分析
• 4.4 部分突变基因功能的预测分析
• 4.5 突变株系376的分析和探讨
• 4.6 空间诱变效应的探讨
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录一 AFLP的引物组合
• 附录二 CTAB法提取大量DNA流程
• 附录三 RNA的小量提取
• 附录四 DNA消化处理（DNaseI处理）
• 附录五 第一链cDNA的合成
• 附录六 RT-PCR扩增保守片段
• 附录七 DNA片段的回收
• 附录八 PCR产物的克隆