神经粘附分子CHL1在神经干前体细胞发育中的功能研究

论文摘要

大脑皮层的发育是由神经干前体细胞(neural stemprogenitor cells, NPCs)有丝分裂和凋亡所决定的。粘附分子作为NPCs生存的微环境,为细胞生长提供了各种信号,维持细胞生长稳定的内环境,在大脑皮层发育以及NPCs增殖和分化调控中具有重要的作用。神经细胞粘附分子CHL1(close homologue of L1)是在小鼠基因组中克隆得到与神经粘附分子L1高度同源的基因,属于粘附分子免疫球蛋白超家族L1亚家族,集中在神经系统表达;胚胎中后期高表达,出生两周后表达降低,稳定至成年。目前关于CHL1在NPCs发育过程中的功能尚未见报道。本研究主要围绕CHL1在大脑皮层发育及NPCs增殖分化中的功能进行研究。主要研究结果如下:1. CHL1在胚胎大脑皮层和NPCs中的表达特点: CHL1在胚胎大脑皮层中间区(intermediate zone, IZ)有较高的表达,皮层板(cortical plate, CP)有少量表达;在胚胎期NPCs主要存在的部位:脑室区室下区(ventricular subventricular zone,VZ SVZ)有表达。在体外培养NPCs中,CHL1与NPCs标志蛋白nestin存在共定位,主要在胞浆表达;且在体外培养NPCs增殖过程中持续稳定的表达。CHL1在胚胎期的表达和定位特点提示其在皮层发育和NPCs增殖分化中有一定的作用。2. CHL1对大脑皮层发育的影响:与同窝野生型小鼠相比,CHL1基因敲除小鼠的存活率没有明显差别,生殖能力不受影响。胚胎发育中后期全脑外观有所增大,四周龄小鼠也存在类似的现象。通过Nissl染色观察CHL1基因敲除对胚胎皮层结构的影响。结果表明:E14.5 CHL1基因敲除小鼠皮层结构形态出现异常,皮层增厚,CP层细胞数量减少,IZSVZ层增厚,细胞排列较松散。皮层发育与NPCs增殖、分化和凋亡密切相关。初步结果显示CHL1基因敲除对E14.5、E16.5时BrdU阳性细胞总数的影响没有统计学差别。早期神经元标志蛋白Tuj1免疫荧光染色结果显示:CHL1基因敲除能够促进未成熟神经元的产生,E14.5最为明显。Tuj1阳性细胞数量显著增加,主要在皮层板、中间区高度表达;脑室区室下区出现了部分Tuj1阳性细胞。CHL1基因敲除后胚胎凋亡细胞的数目减少,没有明显的区域差别。以上结果表明:CHL1基因敲除可能通过促进早期神经元的发生、减少细胞凋亡,从而影响大脑皮层的发育。3. CHL1在NPCs增殖分化调控中的功能:杂合子小鼠交配后次日检栓计算妊娠时间,分离E14.5小鼠NPCs鉴定基因型后分组进行实验。比较克隆形成率、生长曲线、BrdU掺入、细胞周期相关蛋白的表达、增殖指数以及细胞凋亡等指标,结果显示:CHL1缺失能够促进体外培养NPCs的增殖。对诱导分化的NPCs进行神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞标志蛋白免疫荧光染色。结果显示:CHL1缺失促进NPCs向神经元方向分化较野生型具有显著性差异,少突胶质细胞无显著差异。Western blot结果表明:CHL1缺失的NPCs经诱导分化后早期神经元标志蛋白Tuj1表达增加,GFAP表达降低,较野生型具有显著性差异,CNPase的表达未见改变。因此,CHL1缺失促进NPCs向神经元方向的分化,抑制其向胶质细胞方向的分化。4.CHL1在NPCs增殖分化调控中的机制探讨:NPCs增殖过程中ERK1/2信号通路被激活,阻断ERK1/2信号通路后抑制了NPCs的增殖,细胞生长停滞。CHL1缺失能够特异地激活ERK1/2的磷酸化,对p38和JNK没有影响。持续加入ERK1/2阻断剂PD98059后NPCs成球率显著减低,CHL1缺失促进NPCs成球率的作用被部分阻断,NPCs的生长受到抑制;在终浓度40μm时抑制作用最显著,细胞停止生长,较野生型无显著差别。CHL1缺失的NPCs经诱导分化5d后磷酸化ERK1/2的表达略有增加,神经元标志蛋白Tuj1的表达逐渐增加,提示ERK1/2信号通路激活与CHL1缺失促进NPCs神经元方向分化有关。因此,ERK1/2信号通路部分参与了CHL1缺失促进NPCs增殖和神经元方向分化的调控。综上所述,本研究在整体和离体水平证明神经粘附分子CHL1是NPCs发育过程中的负调控因子,ERK1/2信号通路部分参与了CHL1基因敲除促进NPCs增殖和神经元方向分化的调控。

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