不同物种脑中miRNA的克隆及miRNA与物种进化关系初步探讨

论文摘要

目的：利用本实验室改良的miRNA克隆方法及检测方法，我们从鱼纲、两栖纲、爬行纲、鸟纲中分别选取罗非鱼（Oreochromis nilotica）、蟾蜍（Xenopus laevis）、巴西龟（Trachemysscripta elegans）、家鸡（Gallus gallus）四种动物的脑为实验材料，丰富物种的miRNA数据库，并初步探讨miRNA在物种进化中的作用，为研究物种的进化提供新的思路和方法。方法：通过Trizol一步法提取四种动物脑中的总RNA，接着用PEG纯化其中的小分子RNA，再经过poly（A）连尾反应在小RNA的3’端连接上一段poly（A），然后在5’端连上adaptor，用Oligo（dT）primer将连接好的小RNA进行反转录，用根据adaptor和Oligo（dT）primer设计的引物来扩增小RNA，扩增后的小RNA进行胶回收后连接到T载体上，转化TOP10大肠杆菌后挑取阳性克隆进行测序，得到的序列再经过生物信息学的分析后确定是否为miRNA。鉴定出miRNA后，设计其特异性引物利用加尾RT-PCR对其表达进行初步分析。结果：1、利用本实验室改良的miRNA克隆方法，成功从罗非鱼、蟾蜍、巴西龟、家鸡中共克隆到8条长度为15-30bp的小RNA，经过Blast比对，二级结构的分析后确认，分别从罗非鱼、蟾蜍、家鸡中各克隆到1条miRNA候选序列，由于没有龟的全基因组序列及已发表的miRNA序列，因此，我们无法对巴西龟中的克隆所得的序列进行分析，但是从巴西龟中克隆到的序列与罗非鱼中获得的序列是相同的。2、将得到3条miRNA，设计其引物用加尾RT-PCR法对它们在这四种物种中的表达进行分析，结果表明这3条miRNA候选序列在这四种物种中的表达存在差异。3、将得到的3条miRNA候选序列序列与已知功能的miRNA序列进行同源性比对，发现这3条miRNA候选序列与物种的生长发育及新陈代谢相关。结论：miRNAs在不同分类地位的物种中具有相当的保守性，同时miRNAs在不同的物种中有不同的表达分析及功能预测结果表明miRNA可能是促进物种发生突变、推动物种进化主要动力之一。功能预测的结果显示，miRNAs在物种进化的过程中同样也在进化，可能是指导物种进化方向的重要因素之一。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 非编码RNA的简介
• 1.2 miRNA的简介
• 1.2.1 miRNA的发现
• 1.2.2 miRNA的生物合成
• 1.2.3 miRNA的特点
• 1.2.4 miRNA的作用方式
• 1.3 研究背景与思路
• 1.4 研究创新点及意义
• 1.5 技术路线
• 第二章 罗非鱼、蟾蜍、巴西龟和家鸡中相关miRNA分子的克隆
• 2.1 实验材料及仪器
• 2.1.1 分子生物学实验试剂
• 2.1.2 细菌培养用试剂
• 2.1.3 菌株
• 2.1.4 其它试剂及试剂盒
• 2.1.5 RNA接头及引物
• 2.1.6 仪器
• 2.1.7 耗材的处理
• 2.1.8 实验动物简介
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验材料处理
• 2.2.2 总RNA提取
• 2.2.3 小RNA分离
• 2.2.4 小RNA分子加Poly（A）尾
• 2.2.5 小分子RNA5’接头连接
• 2.2.6 cDNA的合成
• 2.2.7 PCR扩增反应
• 2.2.8 电泳及目的条带回收
• 2.2.9 连接反应
• 2.2.10 制备感受态细胞
• 2.2.11 转化及克隆
• 2.2.12 菌落PCR
• 2.2.13 序列测定
• 2.2.14 生物信息学分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 总RNA浓度测定及完整性检测
• 2.3.2 小RNA的富集
• 2.3.3 PCR电泳图
• 2.3.4 菌落PCR鉴定结果
• 2.3.5 测序结果及序列分析
• 2.4 讨论
• 第三章 克隆所得miRNA在鱼类、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类中的表达分析及功能预测
• 3.1 实验材料及仪器
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 其它试剂及试剂盒
• 3.1.3 引物
• 3.1.4 仪器
• 3.1.5 耗材的处理
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 总RNA的提取
• 3.2.2 总RNA分子加Poly（A）尾
• 3.2.3 cDNA合成
• 3.2.4 检测miRNA在四种动物中的表达
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 总RNA浓度及完整性检测
• 3.3.2 检测miRNA在四种动物中的表达
• 3.4 功能预测
• 3.5 讨论
• 第四章 小结与展望
• 1.小结
• 2.展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢