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人参皂苷单体Rh2诱导小鼠前胃癌MFC细胞凋亡的信号转导机制的研究

2020-11-29阅读(909)

人参皂苷单体Rh2诱导小鼠前胃癌MFC细胞凋亡的信号转导机制的研究

论文摘要

人参皂苷单体Rh2（以下简称Rh2）是从红参参根中分离得到的原人参二醇型低糖链皂苷单体,各国研究者已在一些肿瘤细胞体外培养系中[1-5]观察到Rh2对肿瘤细胞的增殖抑制作用,并初步揭示该过程与诱导细胞凋亡、分化及阻滞细胞周期等有关。而对于Rh2对胃癌细胞增殖抑制和相关分子生物学机制尚未见报道。本研究拟以小鼠前胃癌MFC细胞为研究对象,就其抑制胃癌细胞的生长、诱导胃癌细胞凋亡及其相关的分子生物学机制等方面进行较深入探索,为研究与开发中药治疗肿瘤提供科学依据。主要研究内容如下:1、体外培养小鼠前胃癌MFC细胞,采用流式细胞仪分析细胞周期;流式细胞仪和免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白cyclinD1、细胞周期依赖蛋白（CDK）抑制蛋白p27kip1在MFC细胞中的表达;采用Hoechst 33258荧光染色、DNA Ladder、流式细胞术（FCM）观察Rh2对细胞凋亡的影响;激光共聚焦显微系统（LCSM）检测细胞内活性氧的变化;FCM检测细胞线粒体膜电位（△ψmt）和细胞游离钙的变化;WB测定caspase-9、3在细胞中的表达。结果表明,Rh2能强有力促进周期素抑制因子p27kip1的表达,降低cyclinD1的表达,促进细胞内ROS升高,降低线粒体膜电位△Ψmt,提高细胞内游离钙水平,激活下游凋亡执行蛋白caspase-9、3。说明Rh2可通过升高p27kip1,降低cyclinD1含量使胃癌细胞堆积于G0/G1期,有效抑制胃癌细胞分裂增殖,进而主要通过线粒体凋亡途径最终导致胃癌细胞死亡。2、体外培养小鼠前胃癌MFC细胞,加入抗氧化剂NAC、JNK抑制剂SP600125、初步筛选可能参与凋亡过程的靶蛋白。通过WB检测加入NAC、SP600125后MFC细胞中caspase-3、p-JNK、p-c-Jun及p-ATF2蛋白的表达,加入SP600125检测对MFC细胞中caspase-3、Bax、Bcl-2、p53蛋白表达的影响。逐步确定各靶蛋白的上下游级联激活关系。结果表明,除凋亡执行蛋白caspase-9和caspase-3外,ROS、JNK可能为参与凋亡事件的重要靶蛋白。Rh2作用30 min后,ROS产生可使JNK持久激活,进而一方面启动凋亡的线粒体途径,稳定p53,使位于线粒体上的Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达增高,进一步活化caspase-9、3,产生caspase cascade路径的级联放大反应,最终使肿瘤细胞凋亡;另一方面,亦可通过上调核转录因子c-Jun、ATF2的表达,促进AP-1的活性,在转录水平调控凋亡相关蛋白,进而诱导凋亡发生而完成抑制肿瘤细胞分裂增殖进而杀死肿瘤细胞的全过程。

论文目录

  • 提要
  • 第一篇 引言
  • 第二篇 实验研究
  • 2 对小鼠前胃癌 MFC 细胞增殖抑制及凋亡诱导作用'>第一章 Rh2 对小鼠前胃癌 MFC 细胞增殖抑制及凋亡诱导作用
  • 第一节 材料与方法
  • 一、 材料
  • 二、 方法
  • 三、 统计学方法
  • 第二节 结果
  • 2对MFC 细胞的抑制率'>一、 MTT 法测定Rh2对MFC 细胞的抑制率
  • 2对MFC 细胞周期的影响'>二、 Rh2对MFC 细胞周期的影响
  • 2对MFC细胞中cyclinD1及p27kip1抗原表达的影响'>三、 FCM检测Rh2对MFC细胞中cyclinD1及p27kip1抗原表达的影响
  • 2对MFC 细胞中cyclinD1及p27kip1抗原表达的影响'>四、 免疫细胞化学检测Rh2对MFC 细胞中cyclinD1及p27kip1抗原表达的影响
  • 2对MFC 细胞形态学的影响'>五、 Rh2对MFC 细胞形态学的影响
  • 2对MFC 细胞早期凋亡的影响'>六、 Rh2对MFC 细胞早期凋亡的影响
  • 2对MFC 细胞晚期凋亡的影响'>七、 Rh2对MFC 细胞晚期凋亡的影响
  • 2对MFC 细胞线粒体膜电位（△Ψm）的影响'>八、 Rh2对MFC 细胞线粒体膜电位（△Ψm）的影响
  • 2对MFC 细胞内游离钙的影响'>九、 Rh2对MFC 细胞内游离钙的影响
  • 2对MFC 细胞内caspase-9、caspase-3 表达的影响'>十、 Rh2对MFC 细胞内caspase-9、caspase-3 表达的影响
  • 第三节 讨论
  • 2诱导MFC细胞凋亡及其分子机制的研究'>第二章 Rh2诱导MFC细胞凋亡及其分子机制的研究
  • 第一节 材料与方法
  • 一、 材料
  • 二、 方法
  • 三、 统计学分析
  • 第二节 结果
  • 一、 MTT 比色法测定NAC、SP600125 对MFC 细胞活力的影响
  • 二、 NAC、SP600125 对MFC 细胞形态学的影响
  • 三、 FCM 检测SP600125、NAC 对MFC 细胞△ψmt 的影响
  • 四、 FCM 检测SP600125、NAC 对MFC 细胞早期凋亡率的影响
  • 五、 活性氧水平检测
  • 六、 WB 测定 MFC 细胞中p-JNK、p-c-Jun、p-ATF2 蛋白的表达
  • 七、 NAC、SP600125 对MFC 细胞中p-JNK、p-c-Jun、p-ATF2c、aspase-3蛋白表达的影响
  • 八、 SP600125 对MFC 细胞中Bcl-2、Bax、p53 蛋白表达的影响
  • 第三节 讨论
  • 结论
  • 本文创新点
  • 参考文献
  • 附图
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 致谢

    • 相关论文文献

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