论文摘要
聚γ-谷氨酸（poly-y-glutamic acid; y-PGA）是一种是由微生物合成的应用前景良好的生物高分子材料。发酵过程中随着γ-PGA的产生发酵液表现为高粘度和非牛顿流体特征,这就限制了γ-PGA的产量提高及分离纯化,同时不同分子量的γ-PGA用途不同,因此对γ-PGA分子量的控制显得十分重要。γ-PGA降解酶的发现为降低γ-PGA分子量提供了一种有效的工具。目前关于γ-PGA降解酶的报道主要为酶学性质方面的研究,尚未有将γ-PGA降解酶基因在原始菌株中加强表达和敲除来研究其对y-PGA的分子量及产量影响的报道。地衣芽胞杆菌WX-02是本实验室筛选的聚γ-谷氨酸的产生菌,其降解酶的理化性质研究已经完成。本研究分别用枯草芽胞杆菌SacB基因启动子和强启动子P43构建了穿梭表达载体pHY300-SYA和pHY300-PYA,通过电转化地衣芽胞杆菌WX-02获得重组菌株Bacillus licheniformis SYA2和PYA3。降解酶酶活测定结果显示,含有出发质粒的对照菌株B. licheniformis PLK酶活OD570的值为0.503±0.003,而重组菌株B.licheniformis SYA2和PYA3酶活OD570的值分别为0.534±0.002和0.560±0.004,推测B. licheniformis SYA2和PYA3中y-PGA降解酶基因ywtD得到了加强表达,同时也说明P43强启动子强于蔗糖诱导的SacB基因启动子。通过SDS-PAGE电泳分析重组菌株的γ-PGA降解酶,进一步验证了γ-PGA降解酶基因ywtD在重组菌株中得到了加强表达,且γ-PGA降解酶被分泌到胞外,是一种胞外酶。重组菌株的摇瓶发酵结果显示,两个重组菌株的γ-PGA分子量都由1000～1200 kDa降低为800 kDa左右,B.licheniformis PYA3的γ-PGA产量较对照菌株PLK提高了约54%,由13.11g/L提高到20.16g/L,而B. licheniformis SYA2的γ-PGA产量则降低为10.85g/L。因此,通过对地衣芽胞杆菌γ-PGA降解酶基因的加强表达,能够获得高产低分子量γ-PGA的工程菌。本研究还构建了两个用于构建γ-PGA降解酶基因敲除突变菌株的整合载体,有待于进一步研究γ-PGA降解酶基因对γ-PGA合成的影响。