论文摘要
NMDA受体是一种谷氨酸门控的离子通道,与许多复杂的生理和病理机制有关,如突触的可塑性、长时程增强作用（LTP）、学习和记忆、兴奋性神经毒性、神经退行性变性疾病等。NMDA受体由NR1、NR2和NR3亚单位装配组成异聚体离子通道,在内质网组成具有不同生理学和药理学功能以及不同突触靶向的功能性NMDA受体通道。已知NR1亚单位是一个独立的基因家族,通过选择性剪接可产生8个剪接变体;NR2共有4个相关的基因,NR2A、NR2B、NR2C和NR2D:NR3则有2个基因,分别为NR3A和NR3B。目前认为,NMDA受体是分别由两个结合甘氨酸的NR1和两个结合谷氨酸的NR2亚单位组成的异四聚体。因此,NR1/NR2异源二聚体就组成了NMDA受体的基本功能单位。先前的大量研究表明,NMDA受体的不同亚单位单独表达都被滞留在内质网内,只有当NR1与NR2亚单位共同装配才能从内质网输出并表达到细胞膜表面,但其作用机制仍不清楚。近几年来,研究发现NR1亚单位存在一些重要的功能区和调节位点:例如,NR1-1亚单位的C1区存在一个RRR内质网滞留基序（ERretention motif）,使NR1亚单位被滞留在内质网;NR1-4a存在一个共感的PDZ结合区,可以掩盖内质网滞留基序;PKC活化可以帮助NR1-1a表达于细胞膜表面等等。然而,对于NR2B亚单位的内质网滞留机制却仍然知之甚少。与NR1不同的是NR2B亚单位的C末端很长,我们先前的研究已经发现,缺失NR2B亚单位C末端不同区域均未能使得NR2亚单位从内质网输出并获得表面表达,这表明NR2亚单位的内质网滞留机制要比NR1复杂得多。已知NR1-4a单独表达能到达细胞膜表面,为了明确是否是NR2B亚单位C末端决定了它的自身滞留,我们将NR1-4a的C末端替换到NR2B的亚单位C末端。有趣的是,我们发现这样的一个NR2BNR4aC的嵌合体获得了细胞膜表面表达,这个结果表明NR2B亚单位C末端决定了NR2B亚单位的细胞膜表达。但是关于NR2B亚单位C末端如何调控NR2B亚单位的内质网滞留作用仍然不清楚,我们推测并不是由单一位点决定,很可能是通过多个位点协同作用的结果,这还需要进一步的研究证明。另外,关于NR2亚单位单独表达是否能形成功能性受体的研究一直是这个领域的一个热点,目前的主流观点推测NR1是NMDA受体得必需组分,NR2亚单位单独并不能形成有功能得离子通道。基于NR2BNR4ac能单独到达细胞膜表面,我们运用全细胞电生理的方法检测了NR2BNR4ac嵌合体是否能形成有功能的受体通道。电生理结果没有记录到明确的NMDA受体样电流。这个结果提示单独表达NR2亚单位并不能形成有功能的受体通道,只有与NR1共装配才能形成有功能的通道。其次,已知NR1-1a可以通过与NR2装配克服其内质网滞留作用并被输送到细胞膜表面,但其作用机制并不清楚。我们先前的研究试图在NR2上找到克服NR1a内质网滞留基序的功能区,做了各种缺失突变体,但均未能找到特殊的功能区。在本研究中,我们构建了NR2B各种C末端截短质粒,结果发现除了2BA2不能与NR1-1a获得细胞膜表面表达之外,其它的缺失体都能与NR1-1a共表达于细胞膜表面。进一步用全细胞膜片钳技术来记录转染细胞的NMDA受体电流,结果与表面染色结果一致。这些结果表明,NR2B的C末端氨基酸长度对克服NR1-1a的内质网滞留有重要作用,换句话说,NR2亚单位C末端保留三个氨基酸长度对于克服NR1-1a的内质网滞留基序作用是必需的。为了验证这个结果,我们获得了一个NR1-1a-AAA突变体,只把NR1-1a的RRR滞留基序突变成了AAA。然后分别把2B△2与NR1-1a-AAA突变体共转染到HEK293细胞,表面染色结果显示它们能获得细胞膜表达。接下来我们想知道的一个问题是这个氨基酸序列是否具有特异性呢?为了回答这个问题,我们构建了NR2B△5AAAAA突变体,将它与NR1-1a共转染到HEK293细胞后,表面染色和电生理结果都表明它们形成的复合物仍然能够到达细胞膜表面并形成有功能的受体。这个结果表明NR2B第四跨膜区后三个氨基酸长度并没有序列特异性。基于上述结果,本研究第一次发现NR2亚单位C末端保留三个氨基酸长度对于克服NR1-1a的内质网滞留基序是必需的。这种调控机制很可能是通过引发NR1亚单位C末端自身变构的改变,从而掩盖了NR1-1a C末端的内质网滞留基序,使得NR2△3/NR1-1a获得细胞膜表面表达。本研究揭示了一种新的NMDA受体亚单位装配和运输调控机制。另外,本研究运用FRET技术来观察NR2B亚单位的C末端是否影响NMDA受体的装配。将构建好的YFP-2B△2,CFP-2B△2质粒共转染到HEK293细胞,发现它们仍然能够发生FRET,这表明YFP-2B△2与CFP-2B△2能形成复合物。同时,分别将YFP-2B△2与CFP-NR2B或者CFP-NR1-1a共转染到HEK 293细胞,结果发现它们也能发生FRET。这些结果说明缺失了C末端的NR2B亚单位仍然能够与NR1装配形成NMDA受体复合物,提示NR2B的C末端并不是NMDA受体装配的决定位点。最后,在培养的海马神经元中分别单独转染GFP-NR2A,GFP-NR2B,2A△5,2A△3,2A△2,2B△3和2B△2,活细胞表面染色观察它们在神经元的细胞膜表达情况。结果显示2A△5,2A△3,2A△2单独表达到神经元均能到达细胞膜表面,尽管与野生型相比有显著降低。有趣的是,2B△2单独表达在神经元中并不能获得表面表达,但是将NR1-4a与2B△2共转染到神经元中则能够观察到2B△2到达了细胞膜表面,虽然跟野生型相比膜表面表达数目仍然有明显下降。众所周知,在神经元中存在各种内源性的NR1剪接变体,如果NR2能与这些不同的NR1变体装配的话,那么2B△2应该能与NR1-4亚单位装配并到达细胞膜表面,但结果发现2B△2不能到达细胞膜表面。这个结果暗示了一种新的现象,即不同的NR2亚单位并不是随机的与各种NR1变体装配形成NMDA受体,很可能与NR2A和NR2B装配的NR1是不同的变体。综上,本研究主要结论如下:1)发现NR2BNR4aC的嵌合体能获得细胞膜表面表达,电生理结果提示单独表达NR2亚单位不能形成功能性离子通道;2)本研究首次发现NR2亚单位C末端保留三个氨基酸长度对于克服NR1-1a的内质网滞留基序是必需的,揭示了一种新的NMDA受体亚单位装配和运输调控机制。