外源蛋白在毕赤酵母中表达策略—人骨形态发生蛋白4和7的表达研究

论文摘要

作为单细胞真核生物的毕赤酵母（Pichia pastoris）,自开发成外源蛋白表达系统后,倍受研究者们的关注。但Pichia pastoris表达系统还存在一此不够完善的地方,主要表现在以下几个方面:①Pichia pastoris糖基化方式与高等真核生物如哺乳动物存在差别。②外源蛋白在Pichia pastoris中的表达还不稳定。有些能达到克级每升,甚至十几克,而更多的只能达到微克.毫克级的水平。③对于具有前导肽的外源蛋白,目前还很少有报道在Pichia pastoris中表达。Pichia pastoris表达外源蛋白的糖基人源化改造,已有好几个研究团队在进行,且成绩显著。因此,本研究拟在后两个问题上开展研究工作,以期提供一些解决方案。人骨形态发生蛋白（human Bone Morphogenetic Protein hBMP）4、7是TGF-β超家族BMPs亚族的成员,该亚族成员以前体蛋白的形式被翻译,前体蛋白由信号肽、前导肽和成熟肽组成。前体蛋白被分泌后,经加工,切除信号肽和前导肽序列,最后释放出由两个成熟肽单体通过一个二硫键桥组成的二聚体糖蛋白。本研究以hBMP4、7做为报告蛋白,考查稀有密码子、低频密码子和多拷贝表达盒对其表达量的影响;并且探索hBMP4和7全序列在Pichia pastoris中的表达方案。hBMP4、7成熟肽序列亚克隆到Pichiapastoris表达载体pPIC9K中,构建重组质粒并转化P.pastoris宿主菌。摇床发酵表明,含单拷贝的hBMP4没有检测到信号,hBMP7的表达较低,表达量只有5.55mg/L。对hBMP4、7成熟肽序列分析发现,hBMP4中有两个精氨酸密码子使用频率为零,hBMP7中有三个精氨酸密码子使用频率为零。是否是因为hBMP4、7成熟肽中稀有密码子影响了其在P.pastoris中的表达?为了探讨这个问题,本研究利用OE-PCR技术构建了hBMP4、7成熟肽突变序列,将密码子使用频率为零的精氨酸密码子突变成高频密码AGA。突变序列亚克隆到P.pastoris表达载体pPIC9K中进行表达研究。结果表明,突变后的hBMP4成熟肽序列能得到较好表达,表达量达到12mg/L;突变后的hBMP7成熟肽序列表达量也从原来的5.55mg/L增加到了23.59mg/L,表达量提高了近5倍。本研究结果说明了稀有密码子严重影响外源蛋白在P.pastoris中的表达。在hBMP4的成熟肽序列中,除了存在稀有密码子外,还有12个密码子使用频率在0.02-0.05之间的低频密码子,这些低频密码子对hBMP4表达量影响有多大?为了解决这个问题,本研究根据P.pastoris高表达蛋白密码子使用特点结合遗传算法设计了一套序列优化软件,该软件能实现在控制一定比例的AT%组成同时尽可能的使用高频密码子。利用该软件,设计了一条hBMP4成熟肽优化序列,并考查优化序列对hBMP4表达量的影响。结果表明,优化序列能使hBMP4更好的表达,表达量可达到48mg/L,与点突变序列相比表达量提高了3倍。除了密码子会对表达量的影响外,转录水平也会影响外源蛋白的表达。本研究为了考查外源基因的拷贝数对其表达量的影响,利用pAO815表达载体在体外构建了含hBMP7 1、3、5、7、9个拷贝的重组载体,并进行表达研究。研究表明,hBMP7的表达量与其拷贝数之间虽不成线性的关系,但总体上随着拷贝数的增加,表达量也随着增加,9拷贝的表达量约是单拷贝的6倍多。为了研究培养条件对hBMP4表达量和糖基化的影响,在摇瓶培养情况下,对细胞生长影响较大的几个参数如菌体浓度、起始pH值、甲醇浓度、诱导周期、温度和装量被研究。对于hBMP4表达水平来说,较适合的菌体浓度、起始pH值、甲醇浓度和诱导周期分别是OD600=10、pH6.0、1.5%和4-5次（每24h诱导一次）。用发酵罐高密度发酵培养时,hBMP4表达量是摇瓶培养的5倍多。培养条件的变化对hBMP4糖基化没有重大影响。在表达hBMP4、7时发现,hBMP4、7成熟肽在P.pastoris中表达只能得到单聚体,不能形成二聚体的天然构象,表达的hBMP4、7出现过糖基化和糖链不匀地现象,hBMP4还发现N端加工不完全现象。为了考查P.pastoris表达hBMP4、7是否具有生理活性,我们利用色谱层析技术对rhBMP4、7发酵液进行初步纯化,rhBMP4和7的纯度可分别达到83%和90%。纯化后的rhBMP4、7进行生理活性的检测,结果表明,P.pastoris表达的rhBMP4、7能诱导软骨细胞的产生,rhBMP4还能诱导成纤维细胞表达碱性磷酸酶,说明rhBMP4、7虽为单体结构,但具有一定的生理活性。hBMP4和hBMP7前体蛋白由信号肽、前导肽和成熟肽组成,因此是一个很好的研究含前导肽的外源蛋白全序列在P.pastoris中表达的模型。通过构建不同的表达载体进行研究,结果表明,将前导肽与成熟肽之间FURIN蛋白酶切位点R-X-X-R突变成P.pastoris分泌通过中的蛋白酶Kex2和Ste13的酶切位点K-R-E-A能有效将前导肽从成熟肽中切离;只有Kex2酶切位点K-R还不能有效的将外源蛋白前导肽从成熟肽中完全切离。hBMP4的前导肽对其成熟肽的正确折叠有帮助。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1.毕赤酵母表达系统的研究进展
• 1.1 Pichia pastoris表达系统发展简史
• 1.2 外源蛋白在Pichia pastoris中的表达研究
• 1.3 制约Pichia pastoris表达系统发展的因素及可能的解决办法
• 2.hBMP4和7研究概况
• 3.本研究的目的和意义
• 第一章 密码子使用对hBMP4和hBMP7表达量的影响
• 1.材料与方法:
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 工具酶
• 1.3 生化试剂
• 1.4 表达载体pPIC9K-hBMP4,7-mat的构建
• 1.5 表达载体pPIC9K-hBmp4,7-mut构建
• 1.6 表达载体pPIC9-hBMP4-syn的构建
• 1.7 重组质粒的转化到Pichia pastoris宿主菌
• 1.8 转化子的筛选
• 1.9 hBMP4和hBMP7的分泌表达
• 1.10 SDS-PAGE分析
• 1.11 表达产物的Western Blotting分析
• 2 结果
• 2.1 hBMP4,7成熟肽原序列在Pichia pastoris中的表达研究
• 2.2 hBMP4和hBMP7成熟肽点突变序列在Pichia pastoris中的表达研究
• 2.3 hBMP4成熟肽全序列优化对表达量的影响
• 3 讨论
• 第二章 多拷贝基因对hBMP7表达的影响
• 1.材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 主要试剂
• 1.3 pAO815-hBMP7-1c表达载体的构建
• 1.4 多拷贝重组表达质粒pAO815-hBMP7的构建
• 2 结果
• 2.1 hBMP-7成熟肽的多拷贝表达载体的构建
• 2.2 多拷贝hBMP-7成熟肽的分泌表达
• 3.讨论
• 第三章 培养条件对hBMP4表达量和糖基化的影响
• 1.材料与方法
• 1.1 培养基
• 1.2 Dot blotting相对定量分析
• 1.3 hBMP4发酵罐发酵培养
• 2 结果
• 2.1 菌体浓度对hBMP4表达的影响
• 2.2 甲醇浓度对hBMP4表达的影响
• 2.3 起始pH值对hBMP4表达的影响
• 2.4 甲醇诱导周期对hBMP4表达量的影响
• 2.5 装量对hBMP4表达量的影响
• 2.6 培养基组成对hBMP4表达量的影响
• 2.7 发酵罐培养对hBMP4表达的影响
• 2.8 甲醇浓度对hBMP4糖基化的影响
• 2.9 菌体浓度对hBMP4糖基化的影响
• 2.10 培养温度对hBMP4糖基化的影响
• 2.11 装量对hBMP4糖基化的影响
• 2.12 培养基组成对hBMP4糖基化的影响
• 3.讨论
• 第四章 rhBMP4,7分离纯化和生理活性研究
• 1.材料与方法
• 1.1 材料:
• 1.2 有关溶液的配制
• 1.3 rhBMP7纯化
• 1.4 rhBMP4纯化
• 1.5 小鼠肌袋包埋法检测rhBMP4,7生理活性
• 1.6 苏木精-伊红染色（HE）
• 1.7 碱性磷酸酶法检测rhBMP4活性
• 2 结果
• 2.1 rhBMP4纯化结果
• 2.2 rhBMP7纯化结果
• 2.3 小鼠肌袋包埋法检测rhBMP4,7的生理活性
• 2.4 碱性磷酸酶活性法检测rhBMP4的生理活性
• 2.5 Pichia pastoris对rhBMP4和rhBMP7的修饰、加工
• 3.讨论
• 第五章 hBMP4和hBMP7全长序列在Pichia pastoris中的表达研究
• 1.材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 表达质粒pPIC9K-hBMP4-pro-mat的构建
• 1.3 表达质粒pPIC9K-hBMP4-pro-mut的构建
• 1.4 表达质粒pPIC9K-hBMP7-pro-mat的构建
• 1.5 表达质粒pPIC9K-hBMP7-pro-mut的构建
• 2 结果:
• 2.1 hBMP4全序列在Pichia pastoris中的表达
• 2.2 hBMP7全序列在Pichia pastoris中的表达研究
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢