鹅源副粘病毒和鸡新城疫病毒宿主受体差异的分子机制研究

论文摘要

本课题组前期研究结果表明无论从流行病学、病理变化、免疫学特性、全基因组序列上,NA-1株鹅源副粘病毒与经典的新城疫病毒均存在变异。本研究以鹅源副粘病毒NA-1株和新城疫中国标准强毒F48E9株为对象,考察了两株病毒在Vero细胞中的形态发生规律及其引起细胞超微病变的规律,结果表明无论从出芽时间还是出芽后病毒囊膜的完整性上,都提示NA-1株病毒对宿主环境的适应力较强。在组织水平,通过唾液酸糖链连接形式检测技术,应用凝集素免疫组织化学染色方法对正常鸡、鹅和鸭的气管、肠道上皮组织粘膜表面糖链分布用激光共聚焦显微镜观察比较,结果表明鸡气管、肠道上皮粘膜表面同时分布有SAα2-3Gal和SAα2-6Gal结合方式的糖链,而鹅和鸭的气管、肠道上皮粘膜表面只具有SAα2-3Gal结合方式的糖链。运用同样的方法对鸡胚成纤维细胞（CEF）鹅胚成纤维细胞（GEF）和鸭胚成纤维细胞（DEF）表面糖链分布观察,结果表明鸡胚成纤维细胞表面同时分布有SAα2-3Gal和SAα2-6Gal结合方式的糖链,而鹅胚和鸭胚成纤维细胞表面只具有SAα2-3Gal结合方式的糖链。因此可以判断鹅为新城疫病毒单受体分布,而鸡为新城疫病毒双受体分布。在分子水平上,提取鸡胚、鹅胚和鸭胚成纤维细胞病毒受体成分——神经节苷脂,通过高效薄层层析表明三种细胞所含的神经节苷脂成分及含量存在差异。通过高效薄层层析病毒覆盖结合试验（TLC-VOPBA）和病毒红细胞吸附抑制试验结果均表明,NA-1和F48E9两种病毒与神经节苷脂的结合模式存在差异,NA-1与神经节苷脂GD1a,即包含双SAα2,3Gal末端的神经节苷脂结合;F48E9可以结合单唾液酸到三唾液酸形成的神经节苷脂GM1、GD1a、GD1b、GT1b等,提示这两种病毒在入侵靶细胞时优先选择利用的受体不同。使用基于膜表面等离子共振技术（SPR）的Biacore 3000仪器分析比较了两株病毒与不同神经节苷脂结合能力,结果显示NA-1株结合SAα2,3Gal形式的神经节苷脂标准品如GM1、GT1b、GD1a的能力强于F48E9株,且NA-1株对双唾液酸连接的神经节苷脂GD1a结合能力最强,NA-1株与四种细胞神经节苷脂的结合能力依次为GEF>DEF>Vero>CEF,而F48E9株与四种细胞神经节苷脂的结合能力依次为CEF>GEF>Vero>DEF。本实验系统证实了鹅的气管和肠道粘膜上皮细胞只分布有SAα2,3Gal糖链,而没有SAα2,6Gal糖链,确定鹅为新城疫病毒单受体分布且体内病毒易感部位GD1a呈优势分布,而且NA-1株结合GD1a的能力高于F48E9。因此可以认为NA-1在鹅体内及体外环境的长期选择压力下对SAα2,3Gal受体的结合能力逐渐增强,最终使鹅从带毒状态转为发病,从受体水平解释了NA-1株病毒跨越种间传播的分子机制。

论文目录

• 提要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 动物病毒受体研究进展
• 1 病毒受体的特征
• 2 病毒受体与致病性的关系
• 3 病毒及其识别细胞受体能力的进化
• 4 病毒蛋白结构的变化与受体的选择性
• 5 病毒与受体在进化中的共同适应
• 第二章 唾液酸的结构及其作为病毒受体的生物学功能
• 1 唾液酸的分子结构
• 2 唾液酸受体的理化性质
• 3 唾液酸受体的组织分布特点
• 4 包含唾液酸的分子成为病毒受体的条件
• 5 副粘病毒与细胞表面包含唾液酸受体相互作用
• 6 唾液酸受体研究的意义
• 6.1 糖链结构对于宿主和微生物之间的相互作用非常重要
• 6.2 糖基化的种间和种内差异
• 第三章 禽副粘病毒跨越种间传播研究进展
• 1 新城疫病毒及其感染谱
• 2 病毒跨越种间传播的可能机制
• 3 鹅源副粘病毒病发生的生物学基础
• 4 水禽在病毒传播中的生物学意义
• 第二篇 研究内容
• 第一章 NA-1和F48E9在体外培养细胞中的形态发生比较
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 病毒鉴定结果
• 2.2 病毒定量结果
• 2.3 病毒细胞形态发生比较结果
• 3 讨论
• 3.1 病毒增殖方式的确定
• 3.2 病毒形态发生载体细胞的选择
• 3.3 禽副粘病毒Ι型的研究意义
• 3.4 病毒定量
• 3.5 病毒细胞形态发生
• 4 小结
• 第二章 NA-1和F48E9病毒受体在不同禽类组织水平的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 凝集素免疫组织化学检测气管粘膜上皮细胞表面糖链类型及分布
• 2.2 凝集素免疫组织化学检测十二指肠粘膜上皮细胞表面糖链类型及分布
• 3 讨论
• 3.1 鹅、鸡和鸭糖链组织分布的特异性
• 3.2 不同动物组织冰冻切片的制备
• 3.3 凝集素免疫组织化学检测糖链的应用
• 3.4 病毒利用糖链靶向细胞表面
• 3.5 关于糖链分布的不均一性和可变异性及其生物学意义
• 4 小结
• 第三章 NA-1和F48E9病毒受体在不同禽类细胞水平的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 细胞MAA 凝集素免疫组织化学鉴定结果
• 2.2 细胞表面糖链的激光共聚焦定位及光密度值分析结果
• 2.3 细胞 SNA 凝集素免疫组织化学鉴定结果
• 2.4 细胞表面的糖链激光共聚焦定位及光密度值分析结果
• 2.5 其它凝集素免疫组织化学鉴定结果
• 3 讨论
• 3.1 关于神经节苷脂及其细胞定位
• 3.2 细胞水平的免疫组织化学
• 4 小结
• 第四章 NA-1和F48E9病毒受体在分子水平上的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 神经节苷脂提取结果
• 2.1.1 各样品中脂结合唾液酸含量测定结果
• 2.1.2 牛脑神经节苷脂 HPTLC 结果
• 2.1.3 Vero 细胞神经节苷脂提取结果
• 2.1.4 CEF、GEF 和DEF 细胞神经节苷脂提取结果
• 2.2 神经节苷脂提取物的糖链连接类型鉴定结果
• 2.3 HPTLC-VOPBA 结果
• 2.4 神经节苷脂对病毒红细胞吸附抑制实验结果
• 3 讨论
• 3.1 不同细胞唾液酸的分布
• 3.2 NA-1 和F48E9 的HPTLC-VOPBA 结果比较分析
• 3.3 神经节苷脂的高效薄层层析
• 3.4 关于微量糖脂的HPTLC-原位免疫分析检测
• 3.5 细胞中神经节苷脂组成及功能
• 3.6 神经节苷脂在病毒跨域种间传播机制中的作用
• 3.7 禽副粘病毒Ι型受体研究
• 4 小结
• 第五章 NA-1和F48E9与唾液酸受体结合动力学比较
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 脂质体大小和均一性的电镜观察结果
• 2.2 脂质体耦联量的确定
• 2.3 NA-1 和F48E9 病毒与不同神经节苷脂的结合能力比较
• 3 讨论
• 3.1 禽副粘病毒Ι型跨越种间传播机制
• 3.2 通过L1 芯片上的脂质体环境模拟病毒与受体相互作用
• 3.3 SPR
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻博期间发表的学术论文及其他成果
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢
• 导师及作者简介