论文摘要
普通型胃腺癌伴神经内分泌（neuroendocrine，NE）分化，是指胃腺癌中出现分化的NE细胞，但其数目在癌组织成分中所占比例较小，不足50％，并且这些分化的NE细胞多以单个或者细胞巢的形式分散存在。我们以往的研究结果显示，大肠腺癌、胃腺癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中NE细胞的发现率分别为41.5％，39.6％，38.1％，21％和17.9％，并发现在大肠癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中，高分化腺癌NE细胞的发现率明显高于低分化腺癌，而胃癌则相反，低分化腺癌中NE细胞的发生现率明显高于高分化腺癌。这些差异性是否与肿瘤所在部位的胚胎起源、肿瘤病因学、组织发生学的不同及遗传学改变有关，仍处于探索研究阶段。与神经内分泌肿瘤相比，对非神经内分泌肿瘤中NE细胞的研究较少，特别是用分子遗传学方法研究普通型胃腺癌中单个NE细胞的起源方面尚未见报道。关于普通型胃腺癌中NE分化的发生机制存在许多不同的假说，目前多数学者认为NE细胞和上皮细胞均来源于内胚层多潜能干细胞。在肿瘤发生及演进过程中，内胚层的多潜能干细胞受激素、局部微环境及基因组不稳定性的影响，使某些被抑制的基因组密码发生随机脱抑制，在RNA水平选择性激活两种以上调节机制，最终导致基因产生双向或多向分化。然而，这些推测仅建立在形态学观察或者体外实验的基础之上，缺乏可靠性；且不同肿瘤组织中散在的NE细胞不论是在形态上，还是在对肿瘤组织生物学行为的影响上都存在着很大差别，这些散在的NE细胞是否存在染色体及相关基因水平的改变，它们是否为肿瘤的一种成分，还是作为肿瘤的间质成分存在，目前尚不清楚。因此，我们结合激光显微切割（Laser capture microdissection，LCM）技术，对普通型胃腺癌中NE细胞进行分子水平上的研究，以期明确NE细胞的克隆性起源，对这一类型的胃肠道肿瘤做出新的评价，并在分子水平上对整个基因组进行筛选，对微卫星改变发生率较高位点附近胃肠道肿瘤相关基因作进一步的研究，以期详细阐述这些基因与腺癌中NE分化之间的相关性。LCM技术可以使研究者通过简单的操纵杆和按钮获得形态完整的单一细胞或细胞群进行遗传学研究，解决了目的细胞的捕获难题。由于该技术在切除和提取细胞过程中不产生热量，对目的细胞没有任何损伤，即避免了邻近细胞的污染，又不会损伤DNA、RNA。目前国际上很多重要的研究，其材料的获取都是利用了LCM技术。Micro-kit试剂盒可以对微量组织进行DNA抽提，并联合全基因组扩增，以获得足量DNA用于下游实验。干细胞在分化过程中，染色体有丝分裂不均衡，可造成部分基因在两种分化的细胞中同时出现等位基因的改变（如增益、丢失、突变等），此原理，可以通过对微卫星改变（包括微卫星不稳定和杂合性丢失）及突变、CGH等的检测推测组织细胞的克隆性来源，我们在全基因组范围内选取39个微卫星位点，联合p53突变检测，对普通型胃腺癌NE细胞起源问题进行研究，推断肿瘤中NE细胞的起源问题。近年来的分子生物学研究表明，正常细胞增殖的调控信号，大体上可分为促进细胞进入增殖周期并阻止其发生分化的正信号，及抑制细胞进入增殖周期并促进其发生分化的负信号两类。细胞内存在的癌基因和抑癌基因对细胞的生长发育和终末分化就起着这样的正负调控作用。野生型p53（wt-p53）、PTEN及APC作为抑癌基因，在正常组织中参与了DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞凋亡、细胞间相互作用及抑制血管生成等过程。当p53、PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN）、APC（adenomatous polyposis coli，APC）发生突变或缺失时，将丧失上述功能，不但减少对细胞凋亡的调控，还可以促进细胞进入增殖周期，导致细胞的无限增殖。我们通过检测上述基因在NE细胞中的改变（LOH和突变）情况，以明确它们在胃腺癌神经内分泌分化过程中是否发挥着一定的作用。材料和方法本实验收集浙江省人民医院2001—2003年间125例胃腺癌新鲜标本。首先用冷冻切片—嗜铬粒蛋白A（Chromogranin A，CgA）免疫组化方法对上述标本进行初筛，确定含NE细胞较多的组织，经红外线切割获取500个左右单个NE细胞，切割后样本采用DNAMicro-kit抽提试剂盒及Repli-g全基因组扩增试剂盒进行抽提和全基因组放大，全基因组范围内选取39个微卫星位点，结合PCR-SSLP—银染检测腺癌细胞和NE细胞微卫星改变情况，联合PCR-测序检测p53突变发生情况，推测NE细胞的克隆起源；并对杂合性缺失率较高位点附近的胃肠道肿瘤相关基因p53、PTEN、APC做进一步研究，已期明确这些基因与普通型胃腺癌NE分化发生的相关性。结果1、免疫组化—激光显微切割结果：125例胃腺癌新鲜标本中，含有中—大量NE细胞的占28.8％（36／125）。从中挑选30例NE细胞含量较多的组织进行激光显微切割，在40倍物镜下捕获腺癌中单个NE细胞500个左右。2、微卫星分析结果：30例样本，从不同细胞微卫星改变发生率比较，腺癌细胞高于NE细胞。从各位点所在染色体来看，LOH多发生于4q、5q、11p、17q；位点附近为胃肠道肿瘤常见相关基因，而MSI多发生于7p、8p、12q、13q、18q。从两种细胞LOH及MSI一致性来看，例6和例10、14、15、16 LOH在NE细胞中一致性最高，例5、14、29 MSI改变在NE细胞及腺癌细胞中一致性最高，例2、7未发生一致性的LOH改变，而不一致改变的位点较多。从整体水平上看，除例2、7外其余28例样本均有不同程度的LOH及MSI一致性改变。3、p53外显子5-8突变结果：30例样本中腺癌细胞和NE细胞p53突变主要集中在外显子7、8和内含子7，从p53突变的一致性上看，腺癌细胞与NE细胞均发生了外显子7、8及内含子7的一致性突变，一致性突变的有12例。腺癌细胞p53突变有13例（43.3％），NE细胞p53突变有12例（40％）。临床病理资料均显示为浸润性低分化腺癌，TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期。p53突变率与原发普通型胃腺癌组织学分级及TNM分期统计学分析结果（P=0.018，P=0.007），P＜0.05，有显著性差异。4、PTEN在NE细胞中突变结果：30例样本中，PTEN突变主要集中在外显子5和外显子8，其中外显子5有2例，外显子8有6例，共8例，总的突变率为26.7％（8／30）。统计学分析其突变率与组织学分级组间比较结果（P=0.014），P＜0.05，差异性显著，突变率与TNM分期之间组间比较结果（P=0.099），P＞0.05，无显著性差异。5、PTEN、APC微卫星分析结果：30例样本中，PTEN 3个微卫星位点MSI平均检出率为33.3％，频率最高位点为D10S2394（40％），LOH平均检出率为28.7％，频率最高位点为D10S541（36.7％），APC 3个微卫星位点MSI平均检出率为17.8％，频率最高位点为D5S1965（43.3％），LOH平均检出率为6.7％，频率最低位点为D5S346（0）。结论1、首次在分子水平证实胃腺癌中NE细胞起源可能存在同源性。2、P53、PTEN、APC的突变和丢失在胃腺癌NE分化的发生和发展过程中可能发挥着一定的作用。