HGF体外转染骨骼肌细胞及其缺氧条件下对血管内皮细胞凋亡的影响

论文摘要

血管生长因子在缺氧条件下的血管重建过程中，发挥着重要作用。肝细胞生长因子是血管内皮细胞特异性的生长因子，促有丝分裂作用在所有血管内皮细胞生长因子中最强。它与特异性受体C-met结合，在抗内皮细胞凋亡、增强内皮细胞屏障功能及促进内皮依赖的血管扩张等方面发挥重要作用。目前普遍认为缺氧是血管再生的主要诱因，因此，本研究的目的是明确肝细胞生长因子对于缺氧诱导的血管内皮细胞凋亡具有抑制作用。目的将质粒pIRES2-EGFP-HGF转染原代培养的大鼠骨骼肌细胞，观察上清液中HGF的表达及其对缺氧诱导的大鼠血管内皮细胞凋亡的影响。方法1．胰酶消化法建立大鼠原代骨骼肌细胞，差速贴壁法纯化，通过倒置相差显微镜观察培养细胞的生长状态，经Desmin免疫细胞化学法和电镜法鉴定；贴块法建立大鼠原代血管内皮细胞，Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定。2．提取、扩增质粒pIRES2-EGFP-HGF，酶切、测序鉴定；使用阳离子脂质体向骨骼肌细胞转染质粒pIRES2-EGFP-HGF，计算转染效率；ELISA法测定转染质粒后细胞上清液中HGF的表达浓度；并将上清液加入原代培养的血管内皮细胞。3．将含0.5ng／ml、1.0ng／ml、2.0ng／ml、4.00ng／ml四种不同浓度HGF的上清液及空载质粒组和空白对照组的细胞上清液加入到内皮细胞培养液中。在2％缺氧条件下培养12小时后，Hoechst染色、倒置显微镜观察血管内皮细胞凋亡的形态学变化。Annexin V-PI双标染法测定血管内皮细胞早期凋亡率，检测HGF对血管内皮细胞早期凋亡的影响。结果1．通过胰酶消化法建立了大鼠原代骨骼肌细胞，传代时以差速贴壁法纯化，使骨骼肌细胞纯度达到95％以上，细胞融合分化后可见肌管形成，经骨骼肌细胞特异性标志物Desmin免疫细胞化学法和电镜法鉴定，证明培养的细胞是骨骼肌细胞，取2-4代做实验用。2．通过贴块法建立了大鼠原代血管内皮细胞，细胞融合可见典型的“铺路石”样表现，经Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定，证明培养的细胞是血管内皮细胞，并取2-4代做实验用。3．使用阳离子脂质体LipofectamineTM2000、以质粒：脂质体比为1μ∶2μl向骨骼肌细胞转染质粒pIRES2-EGFP-HGF，以GFP荧光表达间接代表HGF表达，测定转染效率为10.8％；ELISA法测定细胞上清液HGF浓度，转染后1天、2天、3天、4天、5天、7天及9天的HGF浓度分别为743.5±170.5pg／ml、1592.5±135.8pg／ml、3424.5±160.3pg／ml、5402.0±227.9pg／ml、6883.8±191.3pg／ml，3563.0±253.9pg／ml，775.1±121.6pg／ml，空载组和空白对照组没有测出HGF。4．FCM结果表明HGF对由于缺氧引起的大鼠血管内皮细胞凋亡具有明显的抑制作用，细胞凋亡率随着HGF浓度的增加而明显降低，同对照组相比差异显著（P＜0.05）。结论1．体外条件下成功分离、培养出大鼠骨骼肌细胞和大鼠血管内皮细胞。2．成功将pIRES2-EGFP-HGF质粒转染大鼠的骨骼肌细胞，转染后骨骼肌细胞可分泌出具有正常功能的HGF蛋白。3．HGF对于因缺氧引起的大鼠血管内皮细胞凋亡具有抑制作用，且具有量效关系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 本文缩略语表
• 前言
• 一、研究的背景
• 二.课题的总体设计
• 第一部分:大鼠骨骼肌细胞及血管内皮细胞的原代培养及鉴定
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分:质粒pIRES2-EGFP-HGF转染骨骼肌细胞及HGF对缺氧条件下血管内皮细胞凋亡的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 致谢