类产碱假单胞菌YS1 BAC文库的筛选及转基因烟草植株遗传稳定性分析

论文摘要

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates,PHAs）,一种由微生物合成的聚酯,由于具有生物降解性、生物相容性等优良性能,而在众多领域,如农业、医药、高分子材料、组织工程、环保和包装材料等方面得到广泛应用。在PHA的合成途径中,PHA合成酶是最关键的酶,对PHA的组成和分子量等性质具有决定性的作用。到目前为止,已经在超过45种细菌中克隆得到了超过59个PHA合成酶基因。 类产碱假单胞菌YS1（Pseudomonas.Pseudoalkaligenese YS1）是一株能合成含短链与中链单体PHA的菌株。本研究通过设计PHB合成酶部分基因特异引物,以菌株Pseudomonas.Pseudoalkaligenese YS1基因组DNA为模板,PCR扩增出一段与Alcaligenes eutrophus PHB合成酶基因phbCj有99%的同源性片段。以PCR产物与Pseudomonas sp.61-3 phbC下游序列中的寡聚核苷酸片段作为共同筛选 P.pseudoalkaligenese YS1 BAC文库的探针,通过斑点杂交初筛,Southern杂交验证,利用亚克隆技术得到外源片段大小为5kb左右的阳性克隆子pH22-E5。 本课题另一部分工作是检测转PHA合酶基因烟草的遗传稳定性。以已获得的两株转PHA合成酶phaC1、phaC2双价基因的烟草及其后代为材料,通过对这株转基因烟草各后代进行PCR、PCR-Southern检测,初步确定P.pseudoalkaligenese YS1 PHA合成酶phaC1、phaC2双价基因能在转基因植株的后代中稳定地遗传,利用卡那霉素抗性大田直接筛选、Southern blot等方法对阳性植株作了进一步检测。用氯仿-次氯酸钠对74株PCR-Southern检测为阳性的转化植株中进行PHAs抽提,有61株中得到目的产物。所转化的烟草在产物合成水平上转化率为67.7%。

论文目录

• 1前言
• 1.1 PHAs及其应用
• 1.1.1 PHAs的分类及性质
• 1.1.2 PHAs的应用
• 1.1.2.1 农业领域
• 1.1.2.2 医药领域
• 1.1.2.3 高分子材料
• 1.1.2.4 组织工程领域
• 1.1.2.5 环境检测
• 1.1.2.6 包装材料
• 1.1.2.7 其他领域
• 1.2 PHA合成酶的特性及其克隆方案
• 1.2.1 PHA合成酶的特性和分类
• 1.2.2 PHA代谢及其其它相关途径中的酶及基因
• 1.2.3 PHA合成酶的基因排列规律
• 1.2.4 PHA合成酶基因的克隆方案
• 1.2.4.1 PCR文库筛选法
• 1.2.4.2 异源表达文库筛选法
• 1.2.4.3 核酸杂交筛选文库
• 1.2.4.4 生物素标记的基因捕获技术
• 1.3 PHA研究的前景展望
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 常用酶和生化试剂
• 2.1.2.1 本研究所用酶及试剂盒
• 2.1.2.2 分子生物学常用生化试剂
• 2.1.3 植物材料
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 技术路线
• 2.3 方法
• 2.3.1 质粒DNA的提取
• 2.3.1.1 质粒DNA的小量提取—碱裂解法（见SAMBROOK ET AL，1989）
• 2.3.1.2 质粒DNA的大量提取和纯化—碱裂解法
• 2.3.1.3 基因组DNA的提取-碱法提取YS1中的基因组DNA（见奥斯伯等，1992）
• 2.3.1.4 1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度及浓度
• 2.3.2 两套探针的制备
• 2.3.2.1 引物的设计
• 2.3.2.2 PSEUDOMONAS PSEUDOALCALIGENESE YS1基因组DNA的PCR扩增
• 2.3.2.3 PCR扩增产物的回收与纯化
• 2.3.2.4 DNA探针的制备
• 2.3.3 点杂交初筛BAC文库重组转化子
• 2.3.3.1 加样杂交
• 2.3.3.2 洗膜
• 2.3.3.3 底物反应
• 2.3.4 质粒DNA的亚克隆实验
• 2.3.4.1 质粒DNA的大量提取
• 2.3.4.2 质粒DNA／载体DNA酶切、去磷酸化
• 2.3.4.3 回收
• 2.3.4.4 连接
• 2.3.4.5 大肠杆菌DH5A感受态细胞的制备（郝林等，1995；彭秀玲等，1997）
• 2.3.4.6 连接产物的转化（谭文斌等，1996）
• 2.3.4.7 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.5 亚克隆重组子进一步克隆分析
• 2.3.6 阳性克隆子的点杂交检测
• 2.3.7 SOUTHERN杂交检测（SAMBROOK ET AL，1989）
• 2.3.7.1 制胶、加样
• 2.3.7.2 转膜
• 2.3.7.3 烤膜、杂交
• 2.3.7.4 洗膜
• 2.3.7.5 底物反应
• 2.3.8 重组菌的摇瓶发酵实验（洪葵等，1998）
• 2.3.8.1 碳源实验
• 2.3.8.2 摇瓶实验
• 2.3.8.3 PHA抽提
• 2.3.9 DNA测序分析
• 2.3.10 转基因烟草植株的鉴定
• 2.3.10.1 烟草总DNA的提取与纯化（SDS法）（王关林等，1998）
• 2.3.10.2 PCR、PCR-SOUTHERN鉴定转基因植株
• 2.3.10.3 SOUTHERN BLOT检测
• 2.3.10.4 卡那霉素抗性大田直接筛选转化植株
• 2.3.11 氯仿-次氯酸钠法抽提获得PHA粗品
• 3 结果与分析
• 3.1 用斑点杂交技术从类产碱假单胞菌YS1 BAC文库初筛PHB合酶基因
• 3.1.1 YS1 BAC文库转化子的提取
• 3.1.2 SOUTHERN杂交筛选探针的制备
• 3.1.3 SOUTHERN斑点杂交筛选P. PSEUDOALCALIGENESE YS1 BAC文库
• 3.2 SOUTHERN BLOT复筛阳性转化子
• 3.2.1 几个强阳性转化子酶切反应条件的优化
• 10亚克隆分析鉴定'>3.2.2 5B₁₀亚克隆分析鉴定
• 3.2.3 pH22-9亚克隆进一步分析鉴定
• 3.2.4 pH22-E5，pH22-E4 SOUTHERN BLOT检测
• 3.2.5 测序
• 3.3 重组菌的摇瓶发酵实验
• 3.4 PHA合成酶基因在转基因烟草中的稳定性分析
• 3.4.1 转基因烟草各后代基因组DNA的小量提取
• 3.4.2 PCR、PCR-SOUTHERN BLOT检测转基因植株
• 1代PCR扩增结果'>3.4.2.1 T₁代PCR扩增结果
• 2代PCR扩增结果'>3.4.2.2 T₂代PCR扩增结果
• 3.4.3 卡那霉素抗性大田直接筛选转化植株
• 3.4.4 SOUTHERN BLOT检测
• 3.4.5 氯仿-次氯酸钠法抽提植物中的PHA
• 4 讨论
• 4.1 关于基因组BAC文库的核酸杂交筛选
• 4.2 利用重组菌生产PHA
• 4.3 关于转基因植物的遗传分析
• 5 结论
• 参考文献
• 缩略语
• 附图
• 附录
• 致谢