壳聚糖酶产生菌的发酵条件及酶学特性的研究

论文摘要

通过富集培养从自然界中筛选出一批产壳聚糖酶的菌株,根据在胶体壳聚糖平板上产生透明圈的大小,挑选出一株产壳聚糖酶最强的菌株K-9。经16SrDNA序列分析该细菌与Ralstonia basilensis的同源性高达99%。通过研究,确定了K-9产酶的最适发酵条件:培养温度30℃,底物壳聚糖浓度1%,装量为500ml三角瓶装100ml培养基,培养基初始pH6.0。在上述培养条件下,第4d时摇瓶中发酵液的最高酶活力达1.36U/ml。K-9能产生诱导型的胞外壳聚糖酶。采用（NH4）2SO4盐析法和凝胶过滤层析对K-9的壳聚糖酶进行分离提纯,得到一种壳聚糖酶,酶经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析,结果显示该酶的分子量约为41.3kD;壳聚糖酶最适反应pH值均为pH4.0,在pH3.0—5.0的酸性环境中保持稳定。酶的最适反应温度为40℃;Mn2+、Na+、K+对该酶的活性有促进作用。Cu2+,Fe3+和Ag+则对该酶的活性都有抑制作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 1.菌株和材料
• 2.培养基
• 3.试剂
• 4.仪器设备
• 5.壳聚糖酶产生菌K-9的筛选
• 5.1 富集培养与平板筛选
• 5.2 平板第二次筛选
• 5.3 摇瓶复筛
• 6.发酵液壳聚糖酶活力的测定
• 6.1 氨基葡萄糖标准曲线制作
• 6.2 壳聚糖酶活力的测定
• 6.3 发酵液中还原糖量的测定
• 7.K-9菌株的部分16SrDNA序列的测定
• 7.1 模板DNA的提取
• 7.2 引物合成
• 7.3 16SrDNA PCR扩增反应条件的优化
• 8 K-9产壳聚糖酶条件的优化
• 8.1 不同培养温度对K-9产壳聚糖酶的影响
• 8.2 培养基不同初始pH值对K-9产酶的影响
• 8.3 K-9产壳聚糖酶的诱导性
• 8.4 不同培养基装量对K-9产酶的影响
• 8.5 不同底物壳聚糖浓度对K-9产酶的影响
• 8.6 四因子三水平正交实验
• 8.7 最适条件下K-9的发酵产酶情况
• 9 K-19壳聚糖酶的提纯与理化性质的初步研究
• 9.1 壳聚糖酶粗酶液的提取与纯化
• 9.2 K-9壳聚糖酶理化性质的初步研究
• 结果
• 1.壳聚糖酶产生菌的筛选和鉴定
• 1.1 富集培养和第一次筛选
• 1.2 第二次筛选
• 1.3 摇瓶复筛
• 2.发酵液壳聚糖酶活力的测定
• 2.1 制定氨基葡萄糖标准曲线
• 2.2 壳聚糖酶活力测定
• 2.3 K-9壳聚糖酶的诱导性
• 3.K-9菌株的部分16SrDNA序列
• 3.1 K-9菌株DNA的提取
• 3.2 PCR反应条件
• 3.3 PCR反应体系（50ul）
• 3.4 PCR扩增产物序列测定及分析
• 4.K-9产壳聚糖酶条件的优化
• 4.1 不同培养温度对K-9产壳聚糖酶的影响
• 4.2 培养基不同初始pH值对K-9产酶的影响
• 4.3 不同培养基装量对K-9产酶的影响
• 4.4 不同底物壳聚糖浓度对K-9产酶的影响
• 4.5 四因子三水平正交实验
• 5.最适条件下K-9的发酵产酶情况
• 6 壳聚糖酶的提纯与理化性质的初步研究
• 6.1 酶的提取与分离纯化
• 6.2 酶的最适反应温度和酶的热稳定性
• 6.3 酶的最适反应PH值和酸碱稳定性
• 6.4 金属离子对酶促反应的影响
• 6.5 酶分子量的确定
• 讨论
• 1.壳聚糖酶产生菌的筛选
• 2.酶活力的测定
• 3.K—9产壳聚糖酶发酵条件的研究
• 4.壳聚糖酶的分离纯化
• 5.K-9壳聚糖酶酶学性质的研究
• 参考文献
• 附综述文章
• 致谢