牛结核诊断方法的比较与牛分枝杆菌的分离与鉴定

论文摘要

近年来,结核病的感染与发病越来越严重。牛结核病与人结核病密切相关。人结核病可以传染给牛,人结核病的存在严重制约着牛结核病的彻底地消灭。牛结核病又能传染给人,牛结核病的存在严重威胁着人类的健康。因此,加强牛结核病的监测,控制牛结核病十分重要。结核病的诊断主要依靠病原学检查,但所需周期长,阳性率不高。皮内变态反应诊断是我国的法定诊断方法,但存在着诸多不足。本论文试图对现在我国常用的诊断方法和国际先进诊断方法进行比较,以促进我国牛结核检疫水平的提高。同时,选择牛结核病阳性的牛,进行牛分枝杆菌分离,并应用先进的基因定型方法进行鉴定。1.国内外诊断方法的比较:同时应用欧盟比较皮内变态反应、传统皮内变态反应对200头奶牛进行试验,3天后,采集这200头牛的肝素抗凝全血,经全血培养、抗原刺激,用BOVIGAMTM干扰素（IFN-γ）试剂盒检测上清。结果200头奶牛中,比较皮内变态反应阳性牛、传统皮内变态反应阳性牛和γ-干扰素阳性牛分别为91头、98头和95头,γ-干扰素检测与传统变态反应、比较变态反应的符合率分别为92.86%和95.79%。此外,3头奶牛在传统变态反应试验中为阳性而在比较变态反应试验中为阴性,证明禽分枝杆菌对传统的牛结核变态反应有干扰。2.牛分枝杆菌分离与鉴定:选择两头国产结核菌素、进口结核菌素皮内变态反应及γ-干扰素均为阳性的牛,进行剖检,采集肺脏、淋巴病变组织进行细菌分离。经5天培养后,均有分枝杆菌生长,将生长的菌接种于改良罗氏培养基扩大培养,抗酸染色均为草兰氏阳性。用DNeasy Tissue Handbook试剂盒同时提取人结核Rv37、标准牛型菌株和2株临床分离株的DNA。以人结核Rv37、标准牛型菌株的DNA作为模板,用16s RNA、Rv0577、IS1561、Rv1510（RD4）、Rv1970（RD7）、Rv3877/8（RD1）和Rv3120（RD12）等7引物建立结核分枝杆菌群的定型PCR方法。用建立的定型PCR方法对提取的临床分离株进行扩增,经与标准菌株比对后,确定分离的细菌为牛型分枝杆菌,分别将其命名为M.bovis-Changping07101和M.bovis-Changping07102。

论文目录

• 前言
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 概述
• 2 结核病流行的情况
• 3 牛结核诊断的研究进展
• 第二章 牛结核诊断方法的比较
• 1 材料与方法
• 1.1 常规设备与仪器
• 1.2 变态反应用PPD
• 1.3 γ-干扰素刺激用试剂
• TM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒'>1.4 BOVIGAM^TM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒
• 1.5 试验牛群
• 1.6 牛结核菌素皮内变态反应试验
• 1.7 欧盟皮内变态反应比较试验
• 1.8 抗凝全血的采集
• 1.9 抗凝全血的分装
• 1.10 伽玛干扰素刺激上清的制备
• 1.11 伽玛干扰素酶标试验的准备
• 1.12 牛γ-干扰素酶免疫试验
• 1.13 病理剖检
• 2 结果
• 2.1 国标变态反应结果
• 2.2 国标和比较变态反应两种试验的比较结果
• 2.3 IFN-γ试验结果
• 2.4IFN-γ试验和变态反应试验的比较结果
• 2.5 病理解剖结果
• 3 讨论
• 第三章 牛结核分枝杆菌的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株
• 1.2 主要溶液
• 1.3 染色液
• 1.4 酶类
• 1.5 其他试剂
• 1.6 主要仪器
• 1.7 引物的合成
• 1.8 制备培养基
• 1.9 口腔分泌液及痰液的采集及处理
• 1.10 病变组织的处理
• 1.11 分枝杆菌的初次培养
• 1.12 分枝杆菌的扩大培养
• 1.13 分枝杆菌的灭活
• 1.14 临床分离菌株的Ziehl-Neelsen（Z-N）染色观察
• 1.15 细菌DNA的提取
• 1.16 细菌DNA的电泳鉴定
• 1.17 细菌DNA的浓度测定
• 1.18 结核分枝杆菌群定型PCR方法的建立
• 1.19 临床分离株的PCR定型
• 2 结果
• 2.1 分枝杆菌的初次培养
• 2.2 分枝杆菌的扩大培养
• 2.3 临床分离菌株的染色观察
• 2.4 细菌DNA的电泳鉴定
• 2.5 细菌DNA的浓度测定
• 2.6 结核分枝杆菌群定型PCR方法的电泳结果
• 2.7 临床分离株PCR定型结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢