论文摘要
前言肾脏移植自从60年代在世界范围内开展以来,因其与透析相比,所受的限制更少,生活的质量更高,一直是终末期肾脏病（ESRD）患者肾脏替代治疗的最佳选择。自从各种免疫抑制剂在临床上的应用,使得移植肾的短期及长期存活率均得到较大的改善。但是移植术后急性排斥反应一直是移植物的长期存活的一道障碍。急性排斥反应的发生机制具有很大的复杂性,有众多因素影响了急性排斥反应的发生,如群体反应性抗体（PRA）,冷热缺血时间,HLA错配以及新近发现的MICA （MHC-I类分子相关相关抗原A）抗体等均是影响移植术后急性排斥反应的发生的重要因素。但是,即使在上述影响素相同的个体中,急性排斥反应发生及移植物的存活仍然存在很大的差别。因此,寻找其他潜在影响急性排斥反应发生的机制,从而改善移植物的存活,一直是移植界学者所追求的目标。基因多态性与肾移植急性排斥反应关系的研究一直都是学术界的热点,但以往的基因多态性研究都是以单核苷酸多态性（SNP）为切入点,例如血小板特异性抗原基因,趋化因子基因等。近年来,基因拷贝数多态性（CNV）的发现使得我们对基因多态性这一现象有了新的更深入的认识,个体之间的基因差异不再只是几个核苷酸碱基的差别,而可能是一整段具有完整功能的基因甚至更长核苷酸片段的差别。现在,大量的基因拷贝数多态性被发现,并且有相当大一部分CNV与疾病易感性有着密切联系,例如神经功能相关的EFNA5, GLUR7, CACNG2及AKAP5基因拷贝数多态性,免疫功能相关的CCL3,CCL4的基因拷贝数多态性等。在2006年Nature杂志上曾报道,Fcgr3B基因拷贝数多态性与系统性红斑狼疮（SLE）及狼疮肾炎（LN）的发病密切相关。移植术后急性排斥反应与SLE及许多自身免疫性疾病在发病机理上有众多相似之处,且Fcgr3B基因对应的蛋白产物FcγⅢB受体在人类主要表达在中性粒细胞表面,而中性粒细胞在移植肾急性排斥活检标本中是一种非常常见炎症浸润细胞。这一系列的关系,使我们联想到Fcgr3B基因拷贝数多态性可能与肾移植术后急性排斥反应的发生有关。本研究中,我们探讨了Fcgr3B基因拷贝数多态性与肾移植术后急性排斥反应的相关性并对其相关机制进行了初步的探讨。第一部分Fcgr3B基因拷贝数多态性与肾移植术后急性排斥反应相关性的研究目的每年终末期肾病（ESRD）患者以7%-8%的比例增加,而肾脏移植是治疗ESRD的最佳选择。随着新型免疫抑制剂的临床应用,急性排斥发生率明显下降,移植物短期存活率明显提高,但10年存活率在活体及尸体肾移植仍较较低。排斥反应仍是肾移植成功的最大障碍。近来许多研究表明Fcgr3B基因拷贝数多态性与自身免疫性疾病的发生存在密切关系,即低Fcgr3B拷贝数个体容易患狼疮性肾炎,小血管炎等疾病。而在临床上,许多自身免疫性疾病与肾移植后排异的发生具有相似的免疫基础背景。由此,本研究旨在探明Fcgr3B基因拷贝数变异是否与肾移植急性排斥反应存在相关性。方法提取1027例肾移植受者及450例健康人外周血DNA,以Fcgr3B为2拷贝的DNA样本为标准品,实时荧光定量PCR标准曲线法检测他们的Fcgr3B基因拷贝数,Sothern Bolt法验证拷贝数结果。比较肾移植受者及健康人群、肾移植术后移植肾功能稳定者及急性排斥者、急性排斥者不同病理类型之间的Fcgr3B基因拷贝数差异。结果在中国汉族人群中,Fcgr3B基因拷贝数频数分布与高加索人群类似,其中肾移植受者中0,1,2,3拷贝的频数分别为5.1%,50.2%,38.1%及5.6%；健康人群0,1,2,3拷贝的频数分别为2.4%,39%,47.3及6.9%。按照最多见的2拷贝为界,<2拷贝的归为低拷贝组,≥2拷贝的归为高拷贝组,健康人群低拷贝数个体频数明显低于肾移植受者（P<0.0001,卡方值22.921,95%可信区间：1.378-2.158）。而在移植肾受者中,移植肾功能稳定者0,1,2,3拷贝的频数分别为4.3%,48.9%,40.0%,5.6%；急性排斥者0,1,2,3拷贝的频数分别为7.9%,55.0%,31.4%,5.2%。急性排斥者低拷贝数个体频数明显高于移植肾功能稳定者（P=0.009,卡方值6.842,95%可信区间：0.495-0.905）。按照Banff标准将移植肾急性排斥组分为急性体液性排斥组（C4d+）,急性细胞性排斥组及临界改变组,就体液性排斥反应而言,其在低拷贝排斥着与高拷贝排斥着中的比例分别为19.4%和21.2%,没有显著差异（P=0.752）。结论中国汉族人群中Fcgr3B基因低拷贝变异（<2拷贝）个体更易发生终末期肾脏病且低拷贝个体在肾移植术后急性排斥反应的发生率升高。第二部分Fcgr3B基因拷贝数变异对肾移植受者中性粒细胞功能的影响目的Fcgr3B基因对应的蛋白产物FcγRⅢB是低亲和力IgG受体中的一员,它通过糖基磷脂酰肌醇基序（GPI）锚定于细胞膜表面,但是并不具有胞内段。FcγRⅢB受体只在人类表达,且主要存在与中性粒细胞膜表面。目前认为,FcγRⅢB受体的主要功能是清除免疫复合物。而拷贝数变化可以通过剂量效应,空间位阻效应以及影响调控元件等多种方式影响表型。本部分研究的目的就是要找出Fcgr3B基因拷贝数变异影响表型改变的机制及其对不同拷贝数个体中性粒细胞功能所产生的影响。方法按照拷贝数分布比例选取高、低拷贝移植肾功能稳定的肾移植受者各15例,其中低拷贝组0拷贝4例,1拷贝11例,高拷贝组2拷贝9例,3拷贝5例,4拷贝1例。采用中性粒细胞分离液分离各拷贝数受者的中性粒细胞。我们应用流式方法,检测了不同拷贝数肾移植受者中性粒细胞表面FcγⅢB受体表达量。接下来我们还应用无菌性的免疫微珠及可溶性免疫复合物与中性粒细胞作用后,流式细胞仪检测不同拷贝数个体中性粒细胞吞噬功能及呼吸爆发功能（检测H202产量）。另外,对于中性粒细胞的趋化功能,我们采用的是Transwell趋化小室实验,以IL-8趋化不同拷贝数中性粒细胞,观察他们趋化能力的差别。考虑到基因拷贝数变异可能对自身及其邻近的基因表达产生影响,我们还利用实时定量PCR方法对不同拷贝数肾移植受者的Fcgr3B、Fcgr2A及Fcgr2B基因mRNA表达进行了检测。结果我们的实验分离的中性粒细胞,其纯度和存活率均在95%以上。FcγⅢB受体在低拷贝肾移植受者中表达量明显低于高拷贝者（中性粒细胞膜表面CD16bFITC平均荧光强度分别为5.61+0.54及12.59+1.33（Mean±EM）,P<0.0001）。而在对免疫微珠的吞噬、呼吸爆发以及趋化能力方面,不同拷贝数肾移植受者的中性粒细胞间没有明显差别。在Fcgr3B及Fcgr2A、Fcgr2B基因mRNA表达上,我们发现,拷贝数高低同Fcgr3B mRNA表达量相关,高拷贝者mRNA表达量明显高于低拷贝者（P<0.0001）。而Fcgr2A基因mRNA表达水平正好相反,低拷贝组则明显高于高拷贝组（P=0.0004）。Fcgr2B基因mRNA表达水平两组间无明显差别（P=0.1026）结论Fcgr3B基因拷贝数变异同其mRNA表达及相应蛋白产物—FcγⅢB受体表达呈正相关,即Fcgr3B对表性的影响可能是一种剂量效应。而这一表型的改变并不影响肾移植受者中性粒细胞吞噬、呼吸爆发、及趋化这三种基本的非特异性免疫功能。第三部分Fcgr3B基因拷贝数变异与肾移植受者急性排斥反应关系机理的初步研究目的在我们前期的研究中,我们发现了低拷贝Fcgr3B的肾移植受者更容易发生急性排斥反应。而中性粒细胞作为数量最为庞大的非特异性免疫细胞,常常被发现在肾移植急性排斥者的移植肾中浸润。目前的研究越来越多的表明,中性粒细胞与移植物急性排斥反应有着密不可分的关系。中性粒细胞能够分泌多种趋化因子和细胞因子,对T、B淋巴细胞有非常强的趋化和激活的作用,从而间接加速了急性排斥反应的发生。要寻找中性粒细胞表面FcγⅢB受体的基因拷贝数多态性与急性排斥反应内在联系的内在机理,我们决定从中性粒细胞在移植排斥中与T、B淋巴细胞的关系,以及中性粒细胞在移植排斥反应中非特异性炎症因子的变化发面入手,研究FcγⅢB受体在这些变化中所扮演的角色,从而找出为什么Fcgr3B低拷贝数肾移植受者易发生急性排斥反应。方法继续针对第二部分的研究对象,我们利用IFN-γ+TNF-α与不同拷贝数肾移植受者中性粒细胞培养12小时,以刺激中性粒细胞表达IP-10, Mig, I-TAC, Blys等T、B细胞的趋化因子和激活因子,采用Real-Time实时荧光定量PCR方法观察各种因子的表达在不同拷贝数间是否存在差异。同时,我们还检测了在IFN-γ+TNF-α刺激后其他非特异性炎症因子（CXCL1、CXCL2、MAC-1、IL-8）的表达在高低拷贝数受者间的差异。此外,我们从高地拷贝组中选取了1拷贝和3拷贝肾移植受者各5例,应用PI-PLC水解中性粒细胞膜表面FcγⅢB受体,抗CD16b单克隆抗体交联FcγⅢB受体两种方法,减弱和增强FcγⅢB受体的功能后检测了IP-10, Mig, I-TAC mRNA表达在增强或者减弱前后的变化。结果不同拷贝数肾移植受者中性粒细胞在接受IFN-γ+TNF-α刺激12小时后,上述细胞因子和趋化因子的表达均有不同程度的升高。而其中IP-10, Mig, I-TAC这三种T细胞相关趋化因子在低拷贝受者中上升的幅度明显高于高拷贝受者上升的幅度（P值分别为0.0211,0.0321,0.0183）。而B细胞活化因子BLys,粘附分子CXCLl、CXCL2、MAC-1及趋化因子IL-8在高低拷贝组间没有明显差异。而在PI-PLC水解中性粒细胞膜表面FcγⅢB受体后,中性粒细胞膜表面FcγⅢB受体表达随着PI-PLC浓度的升高而逐渐降低,而上述三种T细胞相关的趋化因子随着PI-PLC浓度的升高而升高。在抗CD16b单克隆抗体与中性粒细胞膜表面FcγⅢB受体结合后,三种趋化因子的表达较结合前都有所下降,其中,在低拷贝组中,Mig的表达及I-TAC的表达在抗体结合后下降达到统计学差异(P值分别为0.0434及P=0.0457,而高拷贝组中,IP-10的表达在抗体结合后下降达到统计学差异（P=0.0376）结论Fcgr3B基因拷贝数变异影响了T细胞相关的趋化因子IP-10、Mig及I-TAC的mRNA表达,即低拷贝者表达高于高拷贝者,从而间接地影响了肾移植术后不同拷贝数个体中性粒细胞对T细胞的趋化能力,造成了Fcgr3B基因低拷贝者在肾移植术后更易发生急性排斥反应发。
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