C1INH LPS结合位点的筛选与长效蛋白C1INH（14-32）-HAS的表达

论文摘要

革兰氏阴性杆菌感染后引起内毒素血症与内毒素休克的主因是革兰氏阴性杆菌释放的大量脂多糖（LPS）,至今临床上对内毒素血症与内毒素休克还没有很有效的治疗方法。C1抑制物（C1INH）是补体系统的唯一抑制剂,其N-端氨基酸能与LPS结合,对内毒素血症及内毒素休克具有积极的治疗意义。我们首先检测了C1INH N-端1至59氨基酸片段与LPS的结合能力,然后根据其N-端1至59氨基酸序列,设计了7条短肽,经ELISA检测它们与LPS的结合能力,发现其N-端18至30氨基酸C1INH （18-30）的短肽在体外实验中与LPS结合效果最好。为了增强C1INH （18-30）与LPS的结合能力,在其两边共增加六个氨基酸,变成C1INH（14-32）。为了提高C1INH（14-32）在体内的半衰期,我们构建了C1INH（14-32）-HSA融合蛋白,将其在毕赤酵母中进行表达。根据GeneBank（登陆号NM-182488）人C1INH的cDNA序列,以及人血清白蛋白HSA的cDNA序列（登陆号V00495）,设计扩增引物。利用PCR技术将C1INH（14-32）与HSA基因连接起来,然后通过酶切酶连将C1INH（14-32）-HSA与毕赤酵母表达载体pHBM905a连接起来,经过重组子筛选挑选阳性重组子并进行测序。结果表明,该实验成功地将C1INH（14-32）与HSA连接,并成功构建了表达载体pHBM-C1INH（14-32）-HSAo表达载体pHBM-C1INH（14-32）-HSA经Sall线性化后电击转化毕赤酵母GS115,用MD/MM平板进行初筛,得到的重组子进行进一步的诱导表达分析。在经过SDS-PAGE及Western Blotting检测后,表明诱导表达蛋白即为目的蛋白C1INH（14-32）-HSA。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 绪论
• 1 C1INH概述
• 1.1 C1与C1INH
• 1.2 内毒素血症与内毒素休克
• 1.3 C1INH抗LPS感染研究
• 1.4 短肽与LPS
• 2 长效重组蛋白药物
• 2.1 长效制剂
• 2.2 构建突变体
• 2.3 化学修饰
• 2.4 基因融合
• 3. 酵母表达系统
• 3.1 啤酒酵母表达系统
• 3.2 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 3.3 外源基因在酵母中表达产物的分泌
• 3.4 酵母表达系统的优缺点
• 4 立题背景及研究内容
• 第二部分 实验与分析
• 1. C1INH N-端结构域LPS结合位点的筛选
• 1.1 引言
• 1.2 实验材料与仪器设备
• 1.3 方法
• 1.4 结果
• 1.5 小结
• 2. 表达载体pHBM-C1INH（14-32）-HSA的构建
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器设备
• 2.3 方法
• 2.4 结果
• 2.5 小结
• 3 毕赤酵母工程菌的构建与产物鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与仪器设备
• 3.3 方法
• 3.4 结果
• 3.5 小结
• 第三部分 结果与讨论
• 主要结论
• 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢