谷胱甘肽基因的克隆表达及其抗紫外辐射功能的研究

论文摘要

谷胱甘肽（glutathiore,GSH）是一种由甘氨酸、半胱氨酸和γ—谷氨酰氨组成的小分子硫醇类抗氧化剂。本研究详细探讨了谷胱甘肽基因在溶原菌中的表达及对λ原噬菌体紫外诱导的影响。以野生型λ溶原菌为出发菌株,通过增加γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH-Ⅰ）、谷胱甘肽合成酶（GSH-Ⅱ）基因拷贝数的方法构建了过量合成谷胱甘肽的突变菌株,通过缺失gshⅠ基因的方法构建了谷胱甘肽合成缺陷菌株。检测结果显示,在相同的紫外辐射条件下（60J/m2,254 nm）,λ原噬菌体紫外诱导的频率与其宿主菌细胞内的谷胱甘肽含量呈反相关,谷胱甘肽含量最低的合成缺陷株诱导率最高,约为出发株的4.8倍,而谷胱甘肽含量最高的突变株诱导率最低,仅为出发株的28%。相应地,溶原菌抗紫外辐射的能力与细胞内的谷胱甘肽含量呈正相关,谷胱甘肽含量最高的突变株对紫外辐射的抗性也最强,其存活率是出发株的8.5倍,而缺陷株对紫外辐射最敏感,其存活率仅为出发株的16%。本研究显示外源谷胱甘肽同样能够抑λ原噬菌体的紫外诱导,抑制效果与浓度相关。当外源谷胱甘肽达到3 mol/L时,抑制效果高达93%以上。应用电子自旋共振法及自旋捕捉技术,在λ原噬菌体的紫外诱导过程中检测出明显的自由基信号,而且信号的强度则受到内源或外源谷胱甘肽浓度的影响。以上结果说明,自由基在入原噬菌体紫外诱导中起着重要的作用,内源和外源的谷胱甘肽均可以有效地清除诱导过程中产生的自由基,从而抑制λ原噬菌体的紫外诱导。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 谷胱甘肽
• 2 λ噬菌体
• 3 紫外线的诱导效应
• 4 自由基对生物大分子的损伤
• 5 本研究的目的与意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 主要试剂与药物
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 基因gsh-Ⅱ在λ溶原菌中的克隆与表达
• 2.1.1 染色体DNA的提取与纯化
• 2.1.2 基因gsh-Ⅱ的PCR扩增
• 2.1.3 PCR产物的纯化
• 2.1.4 DNA限制性内切酶降解与连接
• 2.1.5 感受态细胞的制备
• 2.1.6 转化
• 2.1.7 转化子的鉴定
• 2.2 基因gsh-Ⅰ在λ溶原菌中的克隆与表达
• 2.2.1 基因gsh-Ⅰ的PCR扩增
• 2.2.2 DNA限制性内切酶降解，连接及转化
• 2.2.3 转化子的鉴定
• 2.3 基因gsh-Ⅰ，gsh-Ⅱ在λ溶原菌中的共表达
• 2.4 谷胱甘肽合成缺陷株的构建
• 2.4.1 cat基因片段的制备
• 2.4.2 电转化
• 2.4.3 重组菌株的鉴定
• 2.4.4 质粒pKD46的消除
• 2.5 不同溶原菌株中λ原噬菌体紫外诱导率的检测
• 2.6 不同λ溶原菌株紫外抗性的检测
• 2.7 外源谷胱甘肽对λ原噬菌体紫外诱导的影响
• 2.7.1 噬菌体裂解液的制备
• 2.7.2 噬菌体效价的测定
• 2.8 电子自旋共振检测
• 结果
• 1 过量表达谷胱甘肽的突变菌株的构建与鉴定
• 1.1 gsh-Ⅱ基因在λ溶原菌中的克隆与表达
• 1.1.1 gsh-Ⅱ基因的PCR扩增
• 1.1.2 重组质粒的构建与转化
• 1.1.3 转化子的鉴定
• 1.2 gsh-Ⅰ基因在λ溶原菌中的克隆与表达
• 1.2.1 gsh-Ⅰ基因的PCR扩增
• 1.2.2 重组质粒的构建与转化
• 1.2.3 转化子的鉴定
• 1.3 基因gsh-Ⅰ，gsh-Ⅱ在入溶原菌中的串联表达
• 1.3.1 重组质粒的构建与转化
• 1.3.2 转化子的鉴定
• 2 谷胱甘肽合成缺陷菌株的构建与鉴定
• 2.1 PCR片段的制备
• 2.2 转化子的筛选和鉴定
• 3 各种λ溶原菌突变株细胞内GSH含量的测定
• 4 不同的谷胱甘肽含量对λ原噬菌体紫外诱导率的影响
• 5 不同的谷胱甘肽含量对λ溶原菌紫外抗性的影响
• 6 外源谷胱甘肽对λ原噬菌体紫外辐射的保护效率
• 7 λ原噬菌体紫外诱导过程中自由基的检测
• 7.1 紫外诱导溶原菌过程中自由基信号的ESR检测
• 7.2 不同GSH含量的λ溶原菌株紫外诱导过程中自由基信号的检测
• 讨论
• 1 溶原菌中谷胱甘肽合成突变株的构建
• 2 谷胱甘肽对λ溶原菌抗紫外辐射的影响
• 3 谷胱甘肽抑制λ原噬菌体紫外诱导的机制
• 4 今后的研究方向
• 主要参考文献
• 在读期间所发表的论文目录
• 致谢