高温应激对猪小肠上皮细胞损伤及清凉颗粒的修复机制

论文摘要

规模化、集约化畜牧生产中,应激无处不在。随着全球性气候变暖,高温作为环境应激因子之一是影响夏季畜禽生产的重要因素。研究证明,高温应激可引起小肠绒毛上皮细胞结构损伤,不仅破坏肠道的屏障功能,而且影响肠上皮细胞对营养物质的消化和吸收,导致生产性能下降等。因此,应激对畜禽肠道结构损伤与修复一直是国内外学者的重要研究方向。抗热应激中药添加剂——清凉颗粒具有缓解高温引起的生产性能和免疫功能下降的功效。为此,本文重点探讨高温对猪小肠上皮细胞结构损伤及清凉颗粒修复的作用机制,为深入开发抗应激中药添加剂和寻找肠道结构损伤修复剂奠定基础。本研究采用48只2月龄左右、体重7.15±0.61kg中国实验用小型猪（CEMP）,公母各半,按窝别、体重相近原则分成3组。分别为对照组、高温组、中药组,每组16头。对照组环境温度23℃,高温组、中药组在人工气候室模拟北京地区的高温环境26-40℃循环变温连续10天高温刺激试验。各组饲喂基础日粮,中药组在基础日粮基础上饮水添加清凉颗粒。试验结果如下：1.第3天时,高温组猪体温（40.22℃±0.25℃）超过正常参照值（38.5℃-39.5℃）上限,日增重（195 g±62 g）下降,明显低于对照组（238 g±80 g）和中药组（230 g±41 g）。热性喘息,嗜睡懒动,饮水增多,生产性能下降。小肠黏膜组织学观察发现,高温组十二指肠、空肠1～3天损伤最为显著,小肠的绒毛高度降低,隐窝深度变浅及绒毛高度／隐窝深度比值减小。6天以后逐渐恢复并接近对照组,说明猪对26～40℃循环变温高温刺激的适应期在6天以上。与高温组相比,中药组体温明显降低,平均日增重提高,小肠的绒毛高度,隐窝深度及其比值均有所改善。说明清凉颗粒能有效调节高温处理猪的体温,促进小肠绒毛损伤的修复,调整小肠绒毛的形态学结构,扩大小肠绒毛吸收面积发挥抗热应激作用,从而缓解高温对猪生理指标和生产性能的不良影响。2.高温组小肠黏膜组织损伤,十二指肠、空肠黏膜DNA、DAO含量在高温组显著下降,第1～3天差异显著。6天以后逐渐恢复并接近对照组,差异不显著。超微结构观察显示,高温组小肠上皮细胞内线粒体、次级溶酶体、转运小泡数量增多,说明细胞通过代谢增强,促进损伤的修复来对抗高温的影响。进一步的研究结果显示,空肠EGF和EGFR蛋白水平呈现先下降后回升；EGFR极显著下降。其mRNA表达与蛋白含量变化趋势一致,说明空肠组织损伤及修复与EGF/EGFR信号下调密切相关。清凉颗粒通过维持小肠黏膜DAO含量,促进DNA合成加快小肠黏膜上皮细胞更新,通过EGF和EGFR基因上调促进小肠绒毛上皮细胞增殖及损伤的修复,维护小肠黏膜屏障的完整性,减轻高温引起的上皮细胞损伤.3.运用Affymetrixz基因芯片技术研究热应激猪空肠的基因表达差异。结果显示高温组与对照组间差异表达基因有143个,其中上调有的68个,下调的有75个（ratio>2或<-2）。结合Go功能分类发现,涉及机体内分泌、免疫功能、细胞损伤和修复、细胞凋亡、信号转导等相关基因的差异表达。Pathway分析结果表明,高温应激可引起猪全基因组的差异表达,占1／3比例的差异基因信号通道与EGF介导的细胞的再生,修复相关,是高温中细胞损伤修复发生的重要机制。4.在体外培养IEC-6高温41℃,3 h刺激模型中,IEC损伤与修复机制的研究结果显示：IEC-6在高温中细胞活力及增殖指数下降,EGF/EGFR mRNA表达明显下降；Western blot检测ERK1/ERK2信号蛋白上调,说明MAPK信号通道与IEC-6热损伤及修复密切相关。苍术及藿香挥发油可通过提高G2M期、S期在上皮细胞周期中的比例,促进细胞增殖,提高细胞活力；上调EGF和EGFR的基因表达,并通过调控MAPK信号通道中P-ERK1/ERK2信号蛋白实现对IEC-6细胞活力／细胞周期、细胞增殖的调控及细胞损伤的修复。

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摘要

ABSTRACT

引言

第一章文献综述

1 应激及热应激的概念

1.1 应激

1.2 应激的机制

1.3 应激引起的病理性变化

1.4 畜牧生产中应激因子及热应激

1.5 高温对猪的影响

2 猪的小肠黏膜损伤与修复

2.1 猪的小肠黏膜结构

2.2 肠上皮细胞的损伤和修复

2.3 小肠上皮组织损伤及修复相关因子

3 基因表达谱在猪热应激中的应用

4 清凉颗粒对猪热应激的调控

4.1 畜禽热应激的调控方法

4.2 畜禽用饲料添加剂、中药添加剂

4.3 中药对肠上皮细胞损伤和修复

5 研究目的、研究内容与技术路线

5.1 研究目的

5.2 主要研究内容及关键技术

5.3 研究的技术路线

第二章高温对猪小肠黏膜形态结构的损伤及清凉颗粒的作用

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验动物饲养管理、分组

2.2 清凉颗粒制备

2.3 主要试剂

2.4 仪器设备

2.5 试验方法

2.6 样品采集、处理与保存

2.7 测试方法

2.8 统计分析

3 结果

3.1 高温中猪的临床表现、体温变化和平均日增重的影响

3.2 高温对猪小肠黏膜形态结构的损伤和清凉颗粒的修复

3.3 高温对热应激猪小肠绒毛及隐窝形态的影响及清凉颗粒的作用效果

4 讨论

4.1 高温中猪的临床表现与热应激

4.2 高温对小肠黏膜组织的形态学损伤

4.3 清凉颗粒对热应激猪的影响

5 小结

第三章高温对小肠黏膜DNA、DAO含量与猪空肠超微结构的影响及清凉颗粒的调节作用

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 试验方法

2.3 统计分析

3 结果

3.1 高温对猪小肠黏膜DNA含量的影响及清凉颗粒的作用效果

3.2 高温对猪小肠黏膜DAO含量的影响及清凉颗粒的作用效果

3.3 高温对猪空肠黏膜形态超微结构的影响

4 讨论

4.1 高温中小肠绒毛DNA及DAO含量的变化

4.2 空肠上皮细胞的超微结构在高温中的变化

4.3 清凉颗粒对小肠黏膜DNA和DAO含量的影响

5 小结

第四章高温对猪空肠黏膜基因差异表达的影响

1 前言

2 材料与方法

2.1 试验动物、分组及采样

2.2 Affymetrix猪基因芯片

2.3 基因芯片检测

2.4 基因芯片信息分析

2.5 基因芯片信息验证

3 结果与分析

3.1 猪空肠黏膜RNA电泳结果

3.2 高温对空肠组织相关的基因表达谱芯片散点图

3.3 生物学信息分析

3.4 RT-PCR验证芯片的结果

4 讨论

4.1 内分泌影响

4.2 影响免疫机能

4.3 影响细胞周期、DNA合成、分裂增殖和损伤修复

4.4 清除自由基、抗氧化

4.5 信号转导

4.6 Pathway分析

5 小结

第五章高温对猪空肠黏膜EGF和EGFR含量和mRNA表达的影响及清凉颗粒的调控效果

1 前言

2 材料与方法

2.1 实验动物与分组

2.2 主要仪器设备及试剂

2.3 采样及样品处理

2.4 检测指标及方法

2.5 统计分析

3 结果

3.1 高温对猪空肠黏膜EGF含量影响及清凉颗粒的调控效果

3.2 高温对猪空肠黏膜EGFR含量影响及清凉颗粒的调控效果

3.3 高温对猪空肠EGF/EGFRmRNA含量影响及清凉颗粒调控效果

4 讨论

4.1 高温对猪空肠黏膜EGF和EGFR表达的影响

4.2 清凉颗粒对热应激猪空肠EGF和EGFR蛋白及其mRNA的调控

5 小结

第六章苍术、藿香挥发油对IEC-6高温下EGF和EGFR mRNA表达的影响及其信号转导机制

1 前言

2 材料与方法

2.1 细胞株、试剂及供试药品

2.2 仪器设备

2.3 试验方法

2.4 统计分析

3 结果

3.1 苍术、藿香挥发油对IEC-6高温下细胞活力变化及增值指数的影响

3.2 苍术、藿香挥发油对IEC-6在高温中EGF/EGFR mRNA表达的影响

3.3 苍术、藿香挥发油对IEC-6在高温中ERK1/ERK2的影响

4 讨论

4.1 苍术、藿香挥发油对高温下IEC-6细胞周期和细胞增值的影响

4.2 苍术、藿香挥发油对IEC-6在高温中EGF-GFR mRNA的影响

4.3 苍术、藿香挥发油对IEC-6在高温中ERK1/ERK2的影响

5 小结

第七章结论、创新点与建议

1 本研究的主要结论

2 本研究的创新点

3 有待进一步研究的问题

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

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