减蛋综合征病毒NE4株全基因组序列测定与分析和环介导等温扩增检测方法的建立

论文摘要

减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus, EDSV）主要引起鸡减蛋综合征,临床表现为产蛋鸡产薄壳蛋或无壳蛋,产蛋率严重下降。自1976年荷兰学者Van Eck首次报道以来,世界各地都分离到减蛋综合征病毒毒株。各毒株间毒力差异大,宿主范围广泛,可在机体内长期繁殖,与Ⅰ群和Ⅱ群禽腺病毒之间无交叉反应,具有独特的抗原性和生物学特性。我国是养禽大国,禽病的发生和流行影响着养禽业的发展,故了解EDSV基因组的结构特点和建立一种快速、特异的诊断技术显得尤为重要。本研究以EDSV NE4株为基础材料,经过鸭胚增毒、提取DNA,并以此为模板,用Premier5.0软件根据减蛋综合征病毒（EDSV-76）Duck adenovirus A株的全基因序列（GenBank序列号AC000004）,设计22对引物,用PCR方法对EDSV-76病毒中国株NE4株的全基因组进行了分段扩增、克隆和序列测定。用DNAStar分析软件对各片段的测序结果进行拼接,并将该序列与GenBank中已登录的相应的序列进行同源性比较分析,并用六邻体蛋白构建了进化树。结果显示,NE4株基因组序列全长33214bp,GC含量为43%,与国际标准株AV-127相比核苷酸序列同源性为99.6%。碱基的插入或缺失主要集中在非编码区,在100K蛋白编码区距羧基端十分之一处插入了一个碱基C,其ORF编码696个氨基酸,而AV-127株100K蛋白编码709个氨基酸,预计其发挥功能的基团在N端。蛋白同源性分析表明,EDSV NE4株主要蛋白与腺病毒OAV（Ovine adenovirus D）和BAV（Bovineadenovirus D）具有较高的同源性,有些蛋白与SAV（Snake adenovirus）腺病毒有较高的同源性,而与CELO的同源性较低,提示NE4株与禽腺病毒Ⅰ群在血清学以及基因结构上存在较大差异,进化分析也显示了此特性。此工作为进一步了解EDSV基因组的结构特点及其与其它腺病毒的同源关系,也为EDSV腺病毒的研究和载体的构建提供清晰的分子生物学背景目前,检测EDSV的方法主要有血凝抑制试验（HI）、琼脂扩散（AGP）试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、PCR和免疫胶体金等检测方法,随着分子生物学技术的不断发展和成熟,作为新生的分子生物学检测方法,环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）应运而生,并成为快速诊断EDSV的有力手段。本研究根据GenBank登录的EDSV-76六邻体基因的保守区设计三对LAMP引物,建立一种高效、快速、高特异性的EDSV LAMP检测方法。优化反应体系,并对其灵敏性、特异性进行验证。结果显示,LAMP检测方法扩增EDSV基因呈特征性梯状条带,显色反应呈绿色荧光。该方法检测EDSV灵敏度高,是普通PCR的10倍,可检测到60个拷贝的基因组DNA;特异性强,与鸡新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡胚致死孤儿病毒（CELO）无交叉反应。重复性好,稳定性高,可经济、有效地在基层和实验室中进行减蛋综合征病毒的检测。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 第一章 减蛋综合症病毒综述
• 1.1 减蛋综合症病毒分子生物学研究进展
• 1.1.1 减蛋综合症病毒的分类和流行病学
• 1.1.2 减蛋综合症病毒的基本生物学特性
• 1.1.3 减蛋综合症毒基因组的基本结构与功能
• 1.2 减蛋综合症病毒诊断方法的研究进展
• 1.3 环介导等温扩增技术（LAMP）及应用
• 1.3.1 环介导等温扩增技术（LAMP）的特点
• 1.3.2 LAMP 反应原理
• 1.3.3 LAMP 反应的应用
• 第二章 减蛋综合征病毒NE4 株全基因组序列测定与分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 病毒
• 2.2.2 试验用仪器和试剂
• 2.2.3 主要试剂配制
• 2.3 方法
• 2.3.1 减蛋综合症病毒的增殖
• 2.3.2 减蛋综合症病毒DNA 的提取
• 2.3.3 EDSV NE4 株基因的克隆与鉴定
• 2.4 结果
• 2.4.1 基因组分段PCR 扩增结果
• 2.4.2 全基因组测序结果与分析
• 2.4.3 EDSV NE4 株主要蛋白同源性比较与分析
• 2.4.4 EDSV NE4 株六邻体蛋白的系统进化分析
• 2.5 讨论
• 第3章 减蛋综合症病毒环介导等温扩增方法的建立
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 病毒
• 3.2.2 试验用仪器和试剂
• 3.2.3 引物设计与合成
• 3.2.4 减蛋综合症病毒的增殖
• 3.2.5 减蛋综合症病毒DNA 的提取
• 3.2.6 LAMP 检测方法反应体系的优化
• 3.2.7 EDSV LAMP 检测
• 3.2.8 LAMP 灵敏度验证
• 3.2.9 LAMP 特异性验证
• 3.2.10 重复性和稳定性检测
• 3.2.11 临床样本检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 LAMP 检测方法反应条件优化结果
• 3.3.2 优化反应条件后建立的LAMP 检测EDSV 基因组DNA 方法
• 3.3.3 LAMP 检测EDSV 灵敏度结果
• 3.3.4 LAMP 检测EDSV 的特异性结果
• 3.3.5 重复性和稳定性检测
• 3.3.6 LAMP 对临床样本的检测
• 3.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 英文缩写词表