马铃薯无标记抗病毒双价表达载体构建与转化

论文摘要

马铃薯为我国北方重要栽培作物,其病毒性退化是生产中存在的主要问题。在诸多引起马铃薯退化的病毒当中,卷叶病毒（PLRV）与纺锤块茎类病毒（PSTVd）的危害不仅减产严重,而且发生十分普遍。有研究表明,蚜虫在传播PLRV的同时助长PSTVd扩散。因此,对于PLRV与PSTVd的共同防治显得尤为重要。以转基因方法培育抗病毒品种是一条经济有效的措施。目前已知利用正单链RNA病毒基因的RNA干扰型结构可使转基因植物获得较高抗病性,而对类病毒最有效的途径是以核酶切割病毒核酸。本试验根据GenBank已报道的PLRV基因组序列,在分析其基因间隔区（IS）及其两端的保守序列基础上,设计并合成两对特异性引物,以PLRV内蒙分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRV IS的两段369bp的cDNA（IS-ClaⅠ-BstpⅠ与IS-Kpn-BglⅡ）。重组质粒pBS-T-IS经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其它分离物的同源序列进行了比对与进化树分析。其结果显示,所克隆的PLRV内蒙分离物的IS序列在PLRV不同株系和分离物之间的同源性很高,最高达到100%,平均为97.90%;同时IS在PLRV全基因组序列中也是相对保守的,且PLRV基因间隔区中存在高度保守的UUAUAUU序列。这表明基因间隔区对于植物病毒的增殖具有普遍的重要作用。同时根据锤头型核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒（PSTVd）负链RNA不同区域位点的双价锤头型核酶基因（DR）。PCR检测、酶切分析和核苷酸序列测定结果说明该核酶合成正确。通过中间表达载体pSKN-DR、pSKN-35S-DR、p3301-DR、pKAN-IS,最终构建了无选择标记的PLRV IS反向重复序列与特异切割PSTVd核酶双价表达载体p3301-DR-Isir。构建过程中,分别对每个重组载体进行了PCR和限制性内切酶检测。核苷酸测序结果表明表达载体p3301-DR-Isir构建成功。采用冻融法将表达载体p3301-DR-Isir导入农杆菌LBA4404,并用农杆菌介导法转化东北白和晋薯7号马铃薯品种,对转化过程中外植体选择、农杆菌侵染浓度、预培养时间、共培养时间对转化效率的影响作了初步研究,明确了根瘤农杆菌介导的马铃薯转化的适宜条件为:外植体预培养2d,农杆菌OD600为0.3-0.5,侵染外植体10min,共培养4 d。供试品种的茎段和叶片均可做外植体使用。本实验成功构建了无选择标记的PLRV IS反向重复序列与特异切割PSTVd核酶的双价表达载体p3301-DR-Isir,为通过遗传转化培育对卷叶病毒和纺锤块茎类病毒双抗的马铃薯品种奠定了基因源材料基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 相关研究进展和立题意义
• 1 RNA干扰与抗病毒基因工程及作物遗传改良
• 1.1 RNA干扰机制及研究进展
• 1.2 RNA干扰技术及其特点
• 1.3 RNAi在作物遗传改良上的应用
• 1.4 RNA干扰在植物抗病毒基因工程中的应用
• 1.5 RNA干扰技术的相关问题与展望
• 2 核酶与抗病毒基因工程
• 2.1 锤头形核酶的结构特点
• 2.2 人工合成核酶的设计原则
• 2.3 锤头型核酶催化机制
• 2.4 核酶的应用展望
• 3 标记基因和无标记转基因研究进展
• 3.1 标记基因在转化系统中的应用
• 3.2 标记基因带来的问题
• 3.3 无抗性标记基因转化系统
• 4 马铃薯卷叶病毒、纺锤块茎类病毒及其抗病毒基因工程
• 4.1 我国马铃薯生产现状及其病毒性病害
• 4.2 马铃薯卷叶病毒
• 4.3 马铃薯纺锤块茎类病毒
• 4.4 马铃薯抗病毒研究进展
• 4.5 抗PLRV基因工程
• 4.6 抗PSTVd基因工程
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 PLRV IS的克隆与抗PSTVd核酶基因合成
• 1 实验材料
• 1.1 质粒载体、宿主菌和植物材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 PCR及测序引物
• 1.5 常用培养基和溶液
• 2 实验方法
• 2.1 PLRV IS基因克隆
• 2.2 特异切割PSTVd RNA的二价核酶的合成
• 3 结果与分析
• 3.1 PLRV IS基因的克隆
• 3.2 核酶的合成
• 4 讨论
• 4.1 改进法提取马铃薯植物总RNA
• 4.2 PLRV IS的克隆和序列分析
• 4.3 核酶的合成
• 第三章 无标记PLRV IS反向重复序列与切割PSTVd核酶双价表达载体p3301-DR-ISir的构建和鉴定
• 1 实验材料
• 1.1 质粒载体、宿主菌和植物材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 PCR检测引物
• 2 实验方法
• 2.1 质粒的酶切与连接
• 2.2 表达载体p3301-DR-Isir的构建策略与构建方法
• 2.3 表达载体p3301-DR-Isir的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 特异切割PSTVd核酶中问载体pSKN-DR的构建与鉴定
• 3.2 特异切割PSTVd核酶中间载体pSKN-35S-DR的构建与鉴定
• 3.3 特异切割PSTVd核酶表达载体p3301-DR的构建与鉴定
• 3.4 PLRV IS中间载体pKAN-IS的构建和鉴定
• 3.5 PLRV IS反向重复序列与切割PSTVd核酶双价表达载体p3301-DR-Isir的构建与鉴定
• 4 讨论
• 第四章 农杆菌介导转化马铃薯初探
• 1 实验材料
• 1.1 质粒载体、宿主菌和植物材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 主要仪器设备和器械的洗涤和消毒
• 1.4 PCR引物
• 1.5 常用培养基和溶液
• 2 实验方法
• 2.1 植物表达载体p3301-DR-ISir向农杆菌感受态细胞的转化
• 2.2 农杆菌介导马铃薯转化
• 3 结果与分析
• 3.1 植物表达载体p3301-DR-ISir向农杆菌感受态细胞的转化
• 3.2 马铃薯最佳转化条件的初步探索
• 4 讨论
• 4.1 影响马铃薯转化率的因素
• 4.2 无标记转基因应用前景
• 5 进一步研究计划
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 攻读硕士研究生期间发表的论文
• 个人简况