水稻稻瘟病抗性基因Pita~2候选基因功能的初步分析

论文摘要

稻瘟病是水稻生产上最具毁灭性的病害之一,严重影响水稻产量。开展稻瘟病新抗性基因的鉴定和研究对抗病育种具有重要的实际意义。稻瘟病新抗性基因Pita2比Pita抗谱更广,为抗稻瘟病育种提供了一个新的抗源。本研究在Pita2精细定位和物理作图的基础上,为对该基因的候选基因进行了预测注释和表达分析,并且利用农杆菌介导的遗传转化对候选基因功能进行了初步的分析,主要结果如下:1.利用公共数据库中日本晴的参考序列,通过生物信息学软件对目的基因区域进行了候选基因的预测注释,结果表明,在目的基因区域共有10个候选基因,其中有5个基因编码区仅100-200 bp,因此选择另外大小合适的5个基因作为该基因的候选基因,分别命名为:Pita2-1,Pita2-2,Pita2-3,Pita2-4,Pita2-5。本研究进一步利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术对Pita2的这些候选基因进行了表达分析,结果表明,5个候选基因中有2个基因在稻瘟病菌接种前后均不表达的,可能是假基因,另外3个基因均表达,可能是有功能的基因。2.将5个候选基因中能从抗病品种PiNo.4扩增出来的4个候选基因全长构建功能互补载体,并对感病品种日本晴进行遗传转化,对T0代的部分转基因植株进行稻瘟病菌研53-33孢子喷雾接种,结果发现Pita2-2和Pita2-5的转基因植株抗病性与是否转入插入片段没有直接联系,可能这两个候选基因并不是Pita2的真实基因,继续鉴定其他候选基因来找出Pita2。3.依据三个表达的基因设计引物,并构建干涉载体Pita2-1RI、Pita2-3RI、Pita2-4RI,通过遗传转化转入抗病品种PiNo.4中。在T0代转基因植株中,苗期经PCR鉴定为阳性的植株,难易成活,未能得到T1代种子。对Pita2-1、Pita2-3、Pita2-4干涉的水稻植株易于在生长早期死亡,尚待进一步证实。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 稻瘟病抗性基因研究的意义
• 1.2 稻瘟病抗性基因研究的进展
• 1.3 植物抗病基因的结构特点以及可能的抗性机制
• 1.3.1 植物抗病基因的结构特点
• 1.3.2 植物抗性基因抗性反应的识别机制
• 1.3.2.1 基因对基因假说
• 1.3.2.2 警卫假说
• 1.4 本研究的内容及意义
• 第二章 稻瘟病抗性基因Pita2候选基因预测与表达分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 分析软件
• 2.2.4 表达分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 候选基因的预测
• 2.3.2 候选基因的表达分析
• 2.4 讨论
• 第三章 稻瘟病抗性基因Pita2候选基因功能互补载体的构建与遗传转化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 载体与菌株
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器设备
• 3.2.5 主要培养基的成分及其制备方法
• 3.3 实验方案
• 2 候选基因的克隆'>3.3.1 Pita²候选基因的克隆
• 2 候选基因扩增'>3.3.1.1 Pita²候选基因扩增
• 3.3.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.3.1.3 PCR 产物回收
• 3.3.1.4 目的片段的酶切
• 3.3.1.5 酶切产物的纯化
• 3.3.1.6 功能互补载体pCAMBIA1300 质粒DNA 的制备
• 3.3.1.7 载体质粒的酶切、去磷酸及其产物的纯化
• 3.3.1.8 目的片段与载体质粒DNA 的连接
• 3.3.1.9 连接产物热激转化大肠杆菌细胞及阳性克隆的鉴定和保存
• 3.3.2 根癌农杆菌EHA105 热激感受态细胞的制备、转化与鉴定
• 3.3.2.1 制备农杆菌EHA105 热激感受态细胞
• 3.3.2.2 重组载体质粒DNA 热激转化农杆菌感受态细胞
• 3.3.2.3 阳性克隆的鉴定和保存
• 3.3.3 农杆菌介导的遗传转化
• 3.3.3.1 水稻胚性愈伤组织诱导和预培养
• 3.3.3.2 农杆菌的活化及悬浮
• 3.3.3.3 愈伤组织的农杆菌侵染及共培养
• 3.3.3.4 抗性愈伤组织的筛选及分化
• 3.3.3.5 幼苗的生根和移栽
• 0 代转基因水稻的分子检测'>3.3.4 T₀代转基因水稻的分子检测
• 3.3.4.1 植物基因组DNA 快速小量提取
• 3.3.4.2 Hpt 基因的PCR 检测
• 0 代转基因水稻人工辅助接种'>3.3.5 T₀代转基因水稻人工辅助接种
• 3.3.5.1 真菌培养基的配制
• 3.3.5.2 稻瘟病菌研53-33 的培养与产孢
• 3.3.5.3 稻瘟病菌人工辅助接种
• 3.4 结果
• 2 候选基因功能互补载体的构建'>3.4.1 Pita²候选基因功能互补载体的构建
• 3.4.2 水稻遗传转化与转基因植株的获得
• 0 代转基因水稻DNA 水平的PCR 检测'>3.4.3 T₀ 代转基因水稻DNA 水平的PCR 检测
• 2候选基因功能互补载体转基因水稻T₀ 代接种结果'>3.4.4 Pita²候选基因功能互补载体转基因水稻T₀代接种结果
• 3.5 讨论
• 3.5.1 关于功能互补载体的构建
• 3.5.2 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 2候选基因干涉载体的构建与遗传转化'>第四章 稻瘟病抗性基因Pita²候选基因干涉载体的构建与遗传转化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 载体与菌株
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 主要仪器设备
• 4.2.5 主要培养基的成分及其制备方法
• 4.3 实验方案
• 2 候选基因干涉载体的构建'>4.3.1 Pita²候选基因干涉载体的构建
• 4.3.1.1 水稻总RNA 的提取
• 4.3.1.2 PiNo.4 cDNA 第一链的合成
• 4.3.1.3 干涉片段的引物设计
• 4.3.1.4 干涉片段的PCR 扩增
• 4.3.1.5 PCR 产物回收、酶切及纯化
• 4.3.1.6 Gateway 技术Topo 试剂盒入门载体的BP 反应
• 4.3.1.7 干涉载体pANDA 质粒DNA 的制备
• 4.3.1.8 Gateway 技术LR 反应干涉载体的构建
• 4.3.1.9 目的片段与载体质粒DNA 的连接
• 4.3.1.10 连接产物热激转化大肠杆菌细胞及阳性克隆的鉴定和保存
• 4.3.2 农杆菌介导的遗传转化
• 4.3.3 转基因水稻的分子检测
• 4.3.3.1 植物基因组DNA 快速小量提取
• 4.3.3.2 guslinker 的PCR 检测
• 4.4 实验结果
• 2 候选基因干涉载体的构建'>4.4.1 Pita²候选基因干涉载体的构建
• 4.4.2 水稻遗传转化与转基因植株的获得
• 0 代转基因水稻DNA 水平的PCR 鉴定'>4.4.3 T₀ 代转基因水稻DNA 水平的PCR 鉴定
• 4.5 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士在读期间发表的论文