大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4和GmPAP14克隆与功能研究

论文摘要

土壤磷素多数以有机态形式存在,不能被植物直接吸收利用。酸性磷酸酶具有分解利用有机态磷、提高磷素吸收利用效率的作用,因而克隆酸性磷酸酶基因,并转化作物,对于解决当前土壤有效磷不足、植物磷素缺乏等问题具有重要意义。本研究利用磷素高效大豆品种“中黄15”,克隆酸性磷酸酶基因,经实时定量PCR和转基因拟南芥磷营养分析研究候选基因的生物学功能,为磷高效转基因育种提供功能基因。研究结果如下:1.克隆获得了2个紫色酸性磷酸酶GmPAP4和GmPAP14。GmPAP4含有1329 bp开放读码框,编码442个氨基酸残基;GmPAP14含有1395 bp开放读码框,编码464个氨基酸残基。2.实时定量分析了不同大豆品种GmPAP4的表达差异性。植酸磷（有机态磷）为唯一磷源条件下,磷高效品种“中黄15”的GmPAP4表达量在植酸磷处理15d70d明显高于磷低效品种“牛毛黄”,表明GmPAP4与植酸磷的吸收利用相关。3.实现了紫色酸性磷酸酶GmPAP4的原核表达。经构建表达载体pET32a-GmPAP4,28℃条件下IPTG诱导12 h出现61.2 KDa目的条带;进一步分离纯化目的条带,并测定其磷酸酶活性发现,目的蛋白具有分解ρ-NPP（硝基苯酚磷酸酯二钠盐,有机态磷）的能力,且以pH 5.0时磷酸酶活性最高。4.分析了GmPAP4编码蛋白在植物细胞中的定位情况。经构建融合表达载体pCamE-GmPAP4::GFP ,基因枪技术转化洋葱表皮细胞发现,转pCamE- GmPAP4::GFP细胞的细胞膜（壁）呈现明显绿色荧光,表明GmPAP4发挥功能的部位在植物细胞膜或者分泌到胞外。5.分析了GmPAP4蛋白在植物不同组织中的定位情况。经农杆菌介导转化技术将pCamE-GmPAP4::GFP转入拟南芥,结果发现转基因拟南芥的根部维管束组织及植株开花期的花粉粒呈现明显绿色荧光,表明GmPAP4与拟南芥根部磷素运输和花粉粒形成有关。6.研究了GmPAP4在转基因拟南芥中的生物学功能。经构建超表达载体pCamE-GmPAP4,农杆菌介导转化拟南芥结果发现,GmPAP4能够在转基因T3代拟南芥中高效表达;且在有机态磷处理下,转基因拟南芥的生物量极显著高于野生型,表明GmPAP4具有分解基质有机态磷、提高磷素利用效率的功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 土壤有效磷缺乏已严重影响作物生长发育
• 1.2 发掘利用磷高效基因是解决作物磷素问题最新途径
• 1.3 酸性磷酸酶对于提高土壤有机磷利用具有重要作用
• 1.4 本研究目的意义
• 2 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试品种
• 2.1.2 试剂材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 大豆幼苗培养与处理
• 2.2.2 总RNA 提取与琼脂糖电泳检测
• 2.2.3 合成cDNA 方法
• 2.2.4 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 和GmPAP14 序列拼接
• 2.2.5 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 和GmPAP14 开放阅读框PCR 扩增
• 2.2.6 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 和GmPAP14 生物信息学分析
• 2.2.7 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 不同品种表达分析
• 2.2.8 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 原核表达
• 2.2.9 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 酶活分析
• 2.2.10 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 亚细胞定位
• 2.2.11 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 超表达载体构建
• 2.2.12 真核表达载体的农杆菌转化方法
• 2.2.13 农杆菌侵染液的制备
• 2.2.14 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 的遗传转化
• 2.2.15 转GmPAP4 拟南芥的筛选
• 2.2.16 转GmPAP4 拟南芥的鉴定
• 2.2.17 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 功能分析
• 3 结果与分析
• 3.1 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 和GmPAP14 的克隆
• 3.1.1 GmPAP4 和GmPAP14 拼接序列的获得
• 3.1.2 大豆植株根系总RNA 提取与cDNA 合成
• 3.1.3 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 和GmPAP14 的克隆
• 3.2 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 和GmPAP14 的生物信息学分析
• 3.2.1 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 的生物信息学分析
• 3.2.2 紫色酸性磷酸酶GmPAP14 生物信息学分析
• 3.2.3 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 和GmPAP14 的同源性分析
• 3.3 GmPAP4 在不同类型大豆品种中的差异表达分析
• 3.4 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 原核表达与酶活测定
• 3.4.1 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 原核表达载体构建
• 3.4.2 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 的原核诱导表达
• 3.4.3 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 酶活检测分析
• 3.5 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 亚细胞定位分析
• 3.5.1 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 融合表达载体的构建
• 3.5.2 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 亚细胞定位分析
• 3.6 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 超表达载体构建与功能分析
• 3.6.1 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 超表达载体构建
• 3.6.2 农杆菌转化拟南芥及阳性植株的获得
• 3.6.3 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 的生物学功能分析
• 4 讨论
• 4.1 紫色酸性磷酸酶及其在植物磷素利用中的作用
• 4.2 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 在细胞中的定位及其作用
• 4.3 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 分解利用有机态磷的能力
• 4.4 GmPAP4 在大豆磷高效与低效品种间的差异表达
• 4.5 紫色酸性磷酸酶GmPAP4 生物学功能的后续研究
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢