RNA干涉沉默CXCR4基因对喉癌侵袭、转移的相关性实验研究

论文摘要

目的:检测趋化因子受体（CXCR4）在喉癌组织中的表达,探讨CXCR4在喉癌发生及发展中的作用;应用RNA干涉技术沉默CXCR4基因,研究CXCR4基因沉默后对喉癌Hep-2细胞株增殖、凋亡、粘附和侵袭的影响。方法:1.应用免疫组织化学SP法检测CXCR4在喉癌组织、癌旁组织、对照组中的表达。2.应用分子生物学技术,模拟内源性miRNA,设计CXCR4基因的shRNAmir,用酶切鉴定、测序检测重组质粒。3.重组质粒用脂质体Lipofectimine 2000转染人喉癌Hep-2细胞。应用免疫组化SP,半定量RT-PCR检测转染后Hep-2细胞中CXCR4蛋白与mRNA的表达水平。4.四甲基偶氮唑盐（MTT）检测转染的重组质粒对喉癌Hep-2细胞体外增殖的影响。5.流式细胞术检测转染的重组质粒的喉癌Hep-2细胞体外凋亡情况。6.半定量RT-PCR检测转染的重组质粒对血管内皮生长因子VEGF与细胞间粘附分子E-CD的mRNA表达水平。7.体外粘附实验检测转染的重组质粒对Hep-2细胞体外与基质粘附能力的影响。8.Transwell小室体外侵袭实验检测转染的重组质粒对Hep-2细胞体外侵袭能力的影响。结果:1.CXCR4蛋白在喉癌组织中呈强阳性表达,蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.01）;在中低分化、淋巴结转移组蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）。2 .构建的重组质粒（ pCXCR4miR/GFP-262、pCXCR4miR/GFP-713、pCXCR4miR/GFP- 961）经酶切鉴定、测序比对后证明所构建的重组质粒成功。3.转染后免疫组化SP检测到72小时后3个重组质粒（pCXCR4miR/GFP-262、pCXCR4miR/GFP-713、pCXCR4miR/GFP-961）的CXCR4蛋白表达量显著下降;半定量RT-PCR显示3个重组质粒CXCR4的mRNA的表达量下降显著,尤以转染pCXCR4miR/GFP-713明显,选用pCXCR4miR/GFP-713用于后续实验。4.MTT比色法检测细胞的增殖,实验组（转染pCXCR4miR/GFP-713的Hep-2组）的细胞的增殖弱于空白对照组（Hep-2组）和阴性对照组（空质粒组）,且差别具有显著性（P<0.01）。5.流式细胞仪检测显示实验组细胞凋亡率明显高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。6.体外粘附实验显示实验组细胞30、60、90、120分钟时的粘附抑制率分别为27.7%、28.9%、25.6%、31.1%,粘附抑制率均高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。7.半定量RT-PCR结果显示实验组VEGF与E-CD mRNA的相对表达水平分别为0.752±0.008, 0.815±0.010,与对照组比较,VEGFmRNA相对表达水平下降（P<0.05）,E-CD mRNA相对表达水平上升（P<0.05）。8.Transwell小室体外侵袭实验显示细胞体外侵袭能力明显降低,实验组的细胞（30±4.119）与阴性对照组（69±6.437）及空白对照组（72±4.535）相比穿膜细胞数明显减少（P<0.01）。结论:CXCR4在喉癌组织中高表达并与喉癌的淋巴结转移、病理分化程度有关。RNA干涉沉默CXCR4基因可影响喉癌Hep-2细胞株增殖、凋亡、粘附和侵袭,CXCR4基因可以作为喉癌基因治疗的靶点,为喉癌的基因治疗提供一条新的途径。

论文目录

• 提要
• 英文缩写词
• 前言
• 第一章 文献综述
• 文献综述之一 CXCR4 综述
• 文献综述之二 miRNA 综述
• 第二章 CXCR4 在喉癌组织中的表达及意义
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 四 小结
• 第三章 CXCR4 shRNAmir 真核表达质粒的构建
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 四 小结
• 第四章 RNA 干涉沉默CXCR4 基因对喉癌Hep-2 细胞株增殖、凋亡、粘附和侵袭的影响
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 四 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表论文
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract