墨汁鬼伞液体发酵培养条件及生物活性研究

论文摘要

墨汁鬼伞（Coprinus atramentarius）又名柳树蘑,柳树钻,是鬼伞属中最有代表性的一种,在真菌界被认定为一种不可食用品种,但其同时具有多种医学保健功能。当前关于墨汁鬼伞的研究报道主要是固体栽培及生物学特性研究,未见关于墨汁鬼伞液体发酵培养的报道,也没有针对其生物活性物质的深入研究。本文对墨汁鬼伞进行液体发酵深层培养,对影响液体发酵的培养基和发酵条件进行全面研究,确定其初步培养条件,然后以菌体生长和胞外多糖为指标对培养基和发酵条件进行了优化。通过全因子中心组合实验设计对发酵培养基进行优化表明:当葡萄糖、玉米粉、麸皮、KH2PO4和MgSO4·7H2O分别为13.51、17.07、7.62、2.29和2.00 g/L时,胞外多糖最大预测值为293.73 mg/L;当上述变量为10.07、18.02、11.63、1.58和4.00 g/L时,菌丝体最大生长量为6.24 g/L。通过Box-Behnken实验设计对发酵条件进行了优化,得到当温度、转速、培养时间、装液量分别为28.4℃、134.5 r/min、119.28 h、180.5 mL/500 mL时,胞外多糖最大预测值为415.58 mg/L;当上述变量为20.45℃、129 r/min、75.12 h、194.5 mL/500 mL时,菌丝体最大生长量为7.26 g/L。对墨汁鬼伞发酵液进行初步分离,得到六个粗组分,为胞内外粗蛋白、粗多糖,及胞内外去除蛋白和多糖的小分子组分。体外试验表明,胞外蛋白和胞外多糖的抗氧化活性最强,非酶糖基化反应抑制率最高。剂量0.1 mg/mL时,胞外蛋白羟自由基清除率为73.57 %（同浓度Vc为66.74 %）,超氧自由基清除率为79.36 %（同浓度Vc为65.74 %）;胞外多糖羟自由基清除率为59.10 %,超氧自由基清除率为52.15 %。剂量0.1 mg/mL时,胞外蛋白和多糖非酶糖基化反应抑制率分别为65.70 %、42.36 %。活性验证试验表明,墨汁鬼伞胞外多糖和胞外蛋白具有良好的抗氧化活性和降血糖功效。为更好地发挥墨汁鬼伞液体发酵成分的活性功能,需对活性粗组分进行分离纯化,精制成高纯度的具有生物活性的制剂。本文对胞外蛋白和胞外多糖进行了初步分离纯化。采用?KTA explorer 100及与其相配套的标准DEAE-纤维素柱和标准凝胶柱对墨汁鬼伞胞外多糖进行了初步分离纯化。采用TOYOPEARL CM-650 M、TOYOPEARL SP-650 M离子交换柱对墨汁鬼伞胞外蛋白进行分离,检测各个组分的体外抗氧化活性,通过SDS-PAGE对活性组分的分子量进行初步探明。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 药食用真菌的研究概况
• 1.2 墨汁鬼伞的研究概况
• 1.2.1 墨汁鬼伞简介
• 1.2.2 墨汁鬼伞培养的研究
• 1.2.3 墨汁鬼伞的应用价值
• 1.2.4 墨汁鬼伞其他方面的研究
• 1.3 本课题研究意义
• 1.4 本课题主要研究内容
• 第二章 墨汁鬼伞液体发酵培养基优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 菌种
• 2.1.1.2 培养基
• 2.1.1.3 主要试剂
• 2.1.1.4 主要仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 接种培养
• 2.1.2.2 生物量计算
• 2.1.2.3 胞外粗多糖产量的测定方法
• 2.1.2.4 试验设计
• 2.1.2.4.1 单因素优化试验
• 2.1.2.4.2 响应面优化试验设计
• 2.2 结果
• 2.2.1 培养基选择
• 2.2.1.1 碳源选择
• 2.2.1.2 氮源选择
• 2.2.1.3 无机盐选择
• 2.2.2 液体发酵培养基优化
• 2.2.2.1 模型建立
• 2.2.2.2 以胞外多糖产量为指标的发酵培养基优化与分析
• 2.2.2.3 以生物量为指标的发酵培养基优化与分析
• 2.2.3 结论
• 2.2.4 验证试验
• 2.3 本章小结
• 第三章 墨汁鬼伞液体发酵条件优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 菌种和培养基
• 3.1.1.2 培养基
• 3.1.1.3 主要试剂与仪器
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 发酵液还原糖的测定
• 3.1.2.2 考察培养时间对菌体生长的影响
• 3.1.2.3 考察接种量对菌体生长的影响
• 3.1.2.4 考察温度、转速、装液量、初始pH 对墨汁鬼伞液体发酵的影响
• 3.1.2.5 响应面试验设计
• 3.1.2.6 接种培养、生物量计算、胞外多糖测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 单因素试验
• 3.2.1.1 接种量对生物量的影响
• 3.2.1.2 培养时间对生物量的影响
• 3.2.1.3 初始pH、装液量、温度、转速对胞外多糖产量和生物量的影响
• 3.2.2 发酵条件响应面优化模型建立
• 3.2.3 发酵条件优化
• 3.2.3.1 以胞外多糖产量为指标的发酵条件优化与分析
• 3.2.3.2 以生物量为指标的发酵条件优化与分析
• 3.2.4 发酵条件优化结论
• 3.2.5 验证试验
• 3.3 本章小结
• 第四章 墨汁鬼伞生物活性研究及活性组分的初步分离纯化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 菌种
• 4.1.1.2 主要试剂
• 4.1.1.3 主要仪器
• 4.1.1.4 发酵液粗分离
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 清除羟自由基（·OH） 活性试验
• 2^-·） 活性试验'>4.1.2.2 抑制超氧阴离子（O₂^-·） 活性试验
• 4.1.2.3 非酶糖基化抑制实验
• 4.1.2.4 胞外粗多糖预处理
• 4.1.2.5 多糖含量的检测
• 4.1.2.6 蛋白含量的检测
• 4.1.2.7 胞外粗多糖的DEAE 纤维素柱的分离
• 4.1.2.8 胞外多糖的Superdex200 分离
• 4.1.2.9 粗蛋白预处理
• 4.1.2.10 墨汁鬼伞胞外粗蛋白的分离纯化
• 4.1.2.11 蛋白的分子量、浓度和含糖量的测定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 发酵液粗组分抗氧化活性
• 4.2.1.1 清除羟自由基（·OH） 能力
• 2^-·） 能力'>4.2.1.2 清除超氧阴离子（O₂^-·） 能力
• 4.2.2 发酵液粗组分抑制非酶糖基化活性
• 4.2.3 胞外粗多糖的EPS 分离分析
• 4.2.3.1 胞外粗多糖的DEAE 离子交换层析分离
• 4.2.3.2 Superdex 200 凝胶柱层析分离
• 4.2.4 胞外粗蛋白EP 的纯化
• 4.3 本章小结
• 全文结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文