棉花植株再生和农杆菌介导的Enhancer trap遗传转化

论文摘要

棉花是我国最重要的经济作物之一，也是我国受虫害影响最严重的农作物之一。利用遗传工程技术改良棉花品种能够提高棉花的种植效益，然而目前棉花的生物技术的发展仍然存在着很多问题，主要表现在棉花遗传转化周期长、导致再生植株的体细胞变异很严重，棉花体细胞胚胎发生对基因型依赖性很强等等。这些问题已经成为棉花生物技术、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克隆等研究领域的障碍和瓶颈。Enhancer trap技术作为功能基因组研究的有力工具，它往往以T-DNA为载体将Enhancer trap元件随机插入到植物基因组中创建植物Enhancer trap系，通过检测不同Enhancer trap系中报告基因的表达模式来发掘新基因及其调节序列。本研究通过建立高效棉花遗传转化体系，采用农杆菌介导的转基因方法，旨在创建棉花T-DNA插入的Enhancer-trap突变系。主要研究结果如下：1为了提高棉花遗传转化效率，针对转化过程中的一些重要影响因素，如菌株、AS、菌液浓度、共培养时间等做了一系列分析实验。实验结果显示：农杆菌浓度0.5OD值左右是比较理想的浓度；MGL菌液培养基中加入50mg／L乙酰丁香酮；共培养温度19℃，暗培养48小时，能够获得较高的转化效率；不同菌株对棉花品种转化效率不相同，菌株LBA4404较C58C3更加适合于以下胚轴为外植体的棉花遗传转化。2在愈伤继代过程中设置不同的2、4-D和Kinetin浓度组合，发现随着2、4-D浓度的降低，愈伤块发绿、变硬、不利于愈伤分化成胚性愈伤。3通过体细胞胚胎发生与农杆菌介导的遗传转化方法，获得了转基因棉花YZ1植株。通过PCR检测和Southern杂交及组织化学染色（GUS染色）证实了已成功将目的基因片断转入到棉花基因组中并成功表达。4报告基因（gus gene）在抗性愈伤、胚性愈伤、幼胚和再生植株根部均能表达，经组织化学染色，在愈伤组织中GUS基因表达频率达到49.3％。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 棉花的组织培养
• 1.1.1 组织培养技术的发展
• 1.1.2 棉花的组织培养和植株再生
• 1.1.3 影响体细胞胚发生和植株再生的因素
• 1.1.3.1 基因型
• 1.1.3.2 外植体
• 1.1.3.3 激素
• 1.1.3.4 培养条件
• 1.2 植物遗传转化方法
• 1.2.1 基因枪法
• 1.2.2 花粉管通道法
• 1.2.3 根癌农杆菌介导法
• 1.2.3.1 农杆菌结构与功能研究
• 1.2.3.2 农杆菌转化的机理
• 1.2.3.3 农杆菌介导法的运用和发展
• 1.2.4 PEG法
• 1.2.5 显微注射法（micro-injection）
• 1.2.6 电激法
• 1.2.7 碳化硅纤维介导转化法
• 1.2.8 其它方法
• 1.3 植物突变体库创建与功能基因组研究
• 1.3.1 植物突变体库的创建
• 1.3.1.1 理化诱变
• 1.3.1.2 植物转座子标签
• 1.3.1.3 农杆菌介导的T-DNA插入突变
• 1.3.1.4 插入突变克隆基因的不足
• 1.4 Gene trap技术在植物功能基因组研究中的应用
• 2 方法和材料
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 根癌农杆菌和转化载体
• 2.1.3 培养条件及其不同培养基配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 转化方法
• 2.2.1.1 无菌苗的制备
• 2.2.1.2 根癌农杆菌感染和共培养
• 2.2.1.3 选择培养
• 2.2.1.4 抗性愈伤组织增殖继代和分化
• 2.2.2 再生苗的嫁接和移栽
• 2.2.2.1 无菌嫁接
• 2.2.2.2 大田移栽
• 2.2.3 转化材料的分子鉴定
• 2.2.3.1 质粒DNA的提取
• 2.2.3.2 棉花基因组DNA的提取
• 2.2.3.3 PCR反应
• 2.2.3.4 Southern杂交
• 2.3 转化体系中的参数调节
• 2.3.1 乙酰丁香酮对转化效率的影响
• 2.3.2 不同菌株转化效率的影响
• 2.3.3 农杆菌浓度对转化效率的影响
• 2.3.4 不同共培养温度对转化效率的影响
• 2.3.5 不同共培养时间对转化效率的影响
• 2.3.6 不同品种转化效率比较
• 3 结果与分析
• 3.1 转化体系参数优化
• 3.1.1 乙酰丁香酮对转化效率的影响
• 3.1.2 不同的农杆菌菌株对转化的影响
• 3.1.3 不同浓度的农杆菌对愈伤组织侵染的影响
• 3.1.4 共培养温度对农杆菌侵染力的影响
• 3.1.5 共培养时间对抗性愈伤组织率的影响
• 3.1.6 不同品种转化效率比较
• 3.2 抗性愈伤继代过程中激素调节
• 3.3 农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化体系的建立
• 3.4 转基因棉花植株的分子检测
• 3.4.1 PCR检测
• 3.4.2 转基因再生植株的Southern杂交分析
• 3.5 GUS基因在转基因植株再生过程中的表达
• 4 讨论
• 4.1 棉花遗传转化中的品种选择和改良
• 4.2 农杆菌介导的遗传传化中外植体的选择
• 4.3 农杆菌转化棉花下胚轴的参数优化
• 4.4 Enhancer trap和Promoter trap在棉花中的表达频率的比较
• 参考文献
• 致谢