猪体细胞核移植及其相关技术研究

论文摘要

体细胞克隆猪在人的动物疾病模型和人类异种器官移植方面具有巨大优势和应用潜力,已经成为当今体细胞克隆领域研究的热点。虽然体细胞克隆猪在几个国家已获得成功,但其克隆效率仍很低（1-2%）。本研究以建立高效的猪体细胞核移植技术体系为目的,系统地研究了影响猪体细胞核移植效率的因素,通过优化相关技术,改善培养条件,达到稳定、大量地生产克隆胚胎,并进行胚胎移植以期获得克隆猪的出生。本研究利用组织块法建立了广西巴马香猪的40d胎儿成纤维细胞系、成年耳成纤维细胞系,以机械刮取法建立了输卵管上皮细胞系,并分离培养了猪卵泡液中的颗粒细胞。研究了冻存对胎儿成纤维细胞的影响以及胎儿成纤维细胞的生长曲线和染色体倍性。实验结果表明,冻存后的胎儿成纤维细胞仍能保持良好的生长状态,细胞生长曲线呈典型的S型,在传代10次之前,染色体倍性正常的比例在92%以上。利用脂质体法转染了质粒pEGFP-cl,研究了细胞密度、DNA、脂质体的用量、DNA脂质体复合物的暴露时间对转染效率的影响。结果表明：24孔板内细胞汇合85%-90%,1.0μg DNA和2.4μL脂质体的用量,暴露4h转染效率最高。优化了卵母细胞体外成熟体系：在NCSU-23+10%PFF中培养的卵母细胞成熟率最高（79.08%）,FBS对卵母细胞体外成熟作用不大；成熟培养液NCSU-23的成熟培养效果略高于TCM 199；在NCSU-23培养液中添加EGF对成熟效率影响不大。经多次孤雌激活实验表明,以200V/mm,60μs,1DC的处理效果最佳；电激活后分别在成熟培养液中添加2mM 6-DMAP进行化学处理,所得的卵裂率略高于对照组、囊胚率显著高于对照组；20μM/L离子霉素激活处理40min激活效果最好；体外成熟培养36h、40h、52h的卵母细胞在卵裂率和囊胚率上明显不如44h、48h,成熟培养48h的卵母细胞卵裂率最高可达81.75%,44h囊胚率最高为22.22%。血清饥饿法和接触抑制法对供核细胞进行细胞周期化处理,诱导细胞进入G0/G1期。各组之间的卵裂率、囊胚率差异不显著,经血清饥饿的供体细胞所得的囊胚率较高。比较了盲吸法、Spindle-view去核法,发现Spindle-view法的去核率可以达到95.76%,是一种安全、高效的去核方法。以胎儿成纤维细胞作为供核体细胞构建的重构胚后期发育效果良好；10代以内的胎儿成纤维细胞更有利于重构胚的发育,融合率、卵裂率和囊胚率都很高。200v,60us,1DC电激活后,在以B2为培养基的培养体系中进行培养,无论在重构胚的融合率、卵裂率和囊胚率上均高于NCSU-23,但差异不显著。从实验成本考虑,采用传统的NCSU-23培养基是可行的。在以上实验的基础上,对实验室获得的早期重构胚胎（1-4细胞胚胎）进行了手术法胚胎移植。移植受体母猪（上海白猪）12头,结果有一头猪顺利怀孕到终期,经剖腹产产下一头健康的克隆巴马小型猪,还有另外三头母猪于移植后51 d、76 d和77d返情,怀孕率33.3%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 引言
• 第一章 文献综述—猪体细胞克隆研究进展
• 1 国内外猪体细胞克隆技术研究的现状、水平
• 2 猪体细胞核移植的关键技术
• 2.1 供体细胞的选择和处理
• 2.1.1 供体细胞类型对猪体细胞核移植的影响
• 2.1.2 体细胞周期同步化对猪体细胞核移植的影响
• 2.2 受体细胞即卵母细胞的去核处理
• 2.3 激活方法对猪重构胚的影响
• 2.4 重构胚胎的培养移植以及受孕的诱导和维持
• 3 小结
• 参考文献
• 第二章 供核体细胞系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要仪器耗材及试剂
• 1.1.2 溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 成年猪耳成纤维细胞系建立
• 1.2.2 胎儿成纤维细胞系建立
• 1.2.3 猪卵巢颗粒细胞系建立
• 1.2.4 猪输卵管上皮细胞系建立
• 1.2.5 细胞传代培养
• 1.2.6 供体细胞液氮冷冻储存
• 1.2.7 供体细胞的复苏
• 1.2.8 细胞染色体计数分析
• 1.2.9 细胞生长曲线
• 1.2.10 供体细胞细胞周期同步化
• 2 结果
• 2.1 猪各种类型细胞系的建立
• 2.1.1 耳成纤维细胞系
• 2.1.2 胎儿成纤维细胞系
• 2.1.3 卵巢颗粒细胞系
• 2.1.4 输卵管上皮细胞
• 2.2 细胞活力检测
• 2.3 胎儿成纤维细胞染色体数目
• 2.4 胎儿成纤维细胞生长曲线
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 转EGFP供核体细胞的制备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器及试剂
• 1.1.2 溶液的配置
• 1.2 方法
• 1.2.1 感受态细胞的制备
• 1.2.2 大肠杆菌的质粒DNA转化
• 1.2.3 质粒DNA快速小提
• 1.2.4 pEGFP-c1的转染
• 1.2.5 转染效率的检测
• 2 结果
• 2.1 不同DNA浓度对转染效率的影响
• 2.2 不同脂质体浓度对转染效率的影响
• 2.3 DNA/脂质体复合物的暴露时间对转染效率的影响
• 2.4 不同细胞汇合度对转染效率的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 卵母细胞体外成熟及孤雌激活
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器与试剂
• 1.1.2 溶液的配置
• 1.2 方法
• 1.2.1 卵母细胞体外成熟
• 1.2.2 卵母细胞孤雌激活
• 2 结果
• 2.1 卵母细胞体外成熟
• 2.1.1 不同培养液对卵母细胞体外成熟的影响
• 2.1.2 PFF和FBS对卵母细胞体外成熟的影响
• 2.1.3 EGF对卵母细胞体外成熟的影响
• 2.2 卵母细胞孤雌激活
• 2.2.1 不同电击参数与激活液对体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响
• 2.2.2 电激活联合化学处理对体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响
• 2.2.3 不同浓度与激活时间的离子霉素对体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响
• 2.2.4 卵龄对体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响
• 2.2.5 猪孤雌胚体外发育形态变化
• 3 讨论
• 3.1 卵母细胞体外成熟
• 3.2 卵母细胞的孤雌激活
• 参考文献
• 第五章 重构胚的构建及体外发育
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 upgrade B2 INRA medium（Laboratoire C.C.D）
• 1.1.2 卵母细胞显微操作液
• 1.2 仪器
• 1.3 显微操作工具的制备
• 1.3.1 制针前玻璃管处理
• 1.3.2 显微操作去核
• 1.3.3 显微操作固定针
• 1.3.4 移卵/胚口吸管
• 1.3.5 融合判定拨卵针
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 卵母细胞体外成熟
• 1.4.2 体细胞核移植
• 1.4.2.1 供体细胞的制备
• 1.4.2.2 受体卵母细胞去核
• 1.4.2.3 去核卵母细胞的核移植
• 1.4.2.4 融合与激活
• 1.4.2.5 胚胎培养
• 1.5 试验设计
• 1.6 统计分析
• 2 结果
• 2.1 不同来源供体细胞构建重构胚后期发育效果的比较
• 2.2 不同传代次数的供体成纤维细胞对重构胚后期发育的影响
• 2.3 不同去核方法对去核率与重构胚后期发育的影响
• 2.4 融合参数对重构胚后期发育的影响
• 3 讨论
• 3.1 关于不同来源类型的供体细胞系
• 3.2 不同传代次数的影响
• 3.3 关于不同的去核方法
• 3.4 不同培养体系
• 参考文献
• 第六章 猪体细胞克隆胚的胚胎移植
• 1 材料方法
• 1.1 猪卵母细胞去核和去核卵母细胞移植
• 1.2 胚胎移植
• 1.2.1 受体母猪的选择
• 1.2.2 受体母猪的发情控制
• 1.2.3 胚胎移植过程
• 1.3 受体母猪妊娠识别和维持
• 1.4 克隆猪的鉴定
• 2 结果
• 3 讨论
• 3.1 受体母猪的选择
• 3.2 受体母猪卵巢的质量和生理状态对核移植胚受孕能力的影响
• 3.3 移植月份的比较
• 3.4 受体母猪的发情控制
• 3.5 受体母猪妊娠识别和维持
• 4 小结
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 附录Ⅰ 部分试剂配方
• 在读期间发表论文的情况