论文摘要
高脂致糖尿病大鼠β细胞功能障碍的机制及胰岛素治疗作用的研究目的:观察高脂对糖尿病（DM）大鼠β细胞功能的影响及其机制,并探讨胰岛素治疗的作用。方法:采用小剂量链脲佐菌素（STZ,25mg/kg体重）和高脂饮食诱导的方法建立DM大鼠模型。DM大鼠随机分为3组:DM高脂饮食（DH）组、DM正常饮食（DN）组和DM高脂饮食及胰岛素治疗（DHI）组;正常Wistar大鼠为正常对照（NC）组。DH组及DHI组大鼠给予高脂喂养,DN组和NC组大鼠给予正常饮食,同时DHI组大鼠给予胰岛素治疗。10周后,行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）,测定血糖和血胰岛素值,并根据血糖和血胰岛素值计算糖负荷后胰岛素增值与血糖增值的比值（△130/△G30）和修正的β细胞胰岛素分泌指数（MBCI）。取胰腺:胰头部分做石蜡切片,胰尾部分液氮保存。SABC方法定位β细胞内的胰岛素,半定量分析胰岛素蛋白的表达,并测定相对β细胞数量和平均β细胞面积。RT-PCR技术半定量分析胰岛素、丝氨酸软脂酰转移酶（SPT）及Caspase-3基因表达。酸乙醇方法抽提胰腺内胰岛素并测定。免疫荧光双标记和免疫印迹法测定β细胞内的增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达。免疫荧光双标记法测定Bcl-2蛋白表达。碘化丙啶（PI）法测定β细胞的凋亡。同时测定血和胰腺内的FFA和TG。结果:与NC组相比,DH组和DN组的血和胰腺内的FFA和TG增加,胰岛素蛋白及基因表达和胰岛素含量下降;葡萄糖刺激的胰岛素分泌曲线低平;△I30/△G30和MBCI下降,其中以DH组更明显（P<0.05）。与NC组相比,DN组和DH组的相对β细胞数量和平均β细胞面积减少;β细胞的凋亡、SPT和Caspase-3基因表达水平均升高,而Bcl-2和PCNA的蛋白表达降低,且以DH组的改变最显著（P<0.05～P<0.01）。与DH组相比,DHI组大鼠经过胰岛素治疗后,血FFA和TG水平虽然没有明显改善,但是胰腺内的TG、FFA明显降低。同时胰岛素基因及蛋白表达和胰岛素含量增加;胰岛素分泌功能、△130/△G30和MBCI改善;相对β细胞数量和平均β细胞面积增加;β细胞凋亡、SPT和Caspase-3基因的表达水平均降低;Bcl-2和PCNA的表达改善（P<0.05～P<0.01）。结论:长期高脂可促使小剂量STZ和高脂饮食诱导的DM大鼠胰岛素分泌功能障碍,且β细胞分泌功能障碍与胰岛素基因和蛋白表达下降致β细胞内的胰岛素含量降低及β细胞增殖降低,凋亡增加致β细胞数量减少有关。胰岛素治疗对高脂所致的上述作用有保护作用,这种保护作用部分和胰腺内FFA及TG沉积改善相关。第一部分DM大鼠模型的建立及其代谢特点的研究目的:观察小剂量STZ和高脂饮食诱导的DM大鼠的血糖、血脂（FFA和TG）、血胰岛素、胰岛素敏感性指数（ISI）和胰岛素抵抗指数的特点。方法:雄性Wistar大鼠随机分为NC组和模型组。模型组大鼠给予STZ（25mg/kg体重）腹腔注射,NC组大鼠给予相应剂量的柠檬酸缓冲液。2w后行OGTT,糖耐量异常者给予高脂饮食。NC组大鼠仍给予正常饮食。模型组大鼠饲以高脂饮食8w后行OGTT,测定血糖,确定DM大鼠模型有无建立。测定DM大鼠血游离脂肪酸（FFA）、血甘油三酯（TG）、血胆固醇（Chol）及血胰岛素,并根据血糖和血胰岛素值计算ISI和胰岛素抵抗指数。结果:DM组大鼠0min、30min、60min和120min的血糖分别为NC组大鼠对应时点血糖的1.5倍、1.4倍、1.5倍和1.6倍,且差异均具有显著性（P<0.01）;同时血FFA、TG和Chol也明显增加,分别为NC组的1.9倍（P<0.01）、1.4倍（P<0.01）和1.6倍（P<0.01）。DM组大鼠空腹胰岛素为NC组大鼠的1.2倍（P<0.05）,并且ISI下降,胰岛素抵抗指数增加,与NC组相比,差异具有显著性（P<0.01、P<0.01）。结论:用小剂量STZ和高脂饮食诱导的DM大鼠具备高血糖、脂代谢紊乱、胰岛素抵抗（IR）和高胰岛素血症的特点。第二部分高脂对DM大鼠胰岛素基因和蛋白表达、胰岛素含量及胰岛素分泌功能的影响目的:观察高脂对DM大鼠β细胞胰岛素基因和蛋白表达、胰岛素含量和胰岛素分泌功能的影响。方法:DM大鼠随机分为2组:DH组和DN组;正常Wistar大鼠为NC组。DH组大鼠继续高脂喂养,DN组大鼠正常饲料喂养。10周后,三组大鼠行OGTT,测定0min、30min、60min和120min的血糖和胰岛素值。并根据血糖和血胰岛素值计算△130/△G30和MBCI。取胰腺:胰头部分做石蜡切片,胰尾部分液氮保存。SABC方法定位β细胞内的胰岛素,并半定量分析胰岛素蛋白的表达。RT-PCR技术半定量分析胰岛素基因表达,酸乙醇方法抽提胰腺内胰岛素并测定。同时测定血和胰腺内的FFA和TG。结果:与NC组相比,DH组和DN组的血和胰腺内的FFA和TG增加,葡萄糖刺激的胰岛素分泌曲线低平,△130/△G30和MBCI显著下降,以DH组为著,差异均具有显著性（P<0.05～P<0.01）。DN组和DH组胰岛素蛋白和基因表达及胰岛素含量均明显低于NC组,其中以DH组降低更明显（P<0.05）。结论:长期高脂可损伤DM大鼠胰岛素基因和蛋白的表达,同时细胞内的胰岛素含量降低,β细胞胰岛素分泌功能显著下降。且高脂导致的上述改变可能和胰腺内的脂质沉积有关。第三部分高脂对DM大鼠β细胞数量的影响及β细胞凋亡可能的影响因素目的:观察高脂对DM大鼠β细胞增殖、β细胞凋亡及β细胞数量的影响及凋亡的相关因素。方法:SABC法定位NC组、DN组和DH组大鼠β细胞内的胰岛素后,测定平均β细胞面积和相对B细胞数量;免疫荧光双标记和免疫印迹法测定β细胞内的PCNA蛋白表达;免疫荧光双标记法测定Bcl-2蛋白表达;PI法测定β细胞的凋亡;并应用RT-PCR技术检测凋亡相关蛋白丝氨酸软脂酰转移酶（SPT）和Caspase-3的基因表达。结果:DN组和DH组的相对β细胞数量和平均β细胞面积均较NC组减少（P<0.05～P<0.01）,且以DH组的改变显著（P<0.05）。DN组的β细胞的凋亡率、SPT和Caspase-3基因表达水平较NC组升高,而Bcl-2和PCNA的蛋白表达较NC组下降（P<0.05）。DH组的β细胞凋亡、SPT和Caspase-3基因表达的升高和Bcl-2及PCNA蛋白表达的下降则进一步加剧（vs DN组,P<0.05～P<0.01）。结论:高脂可导致DM大鼠β细胞数量减少,这种数量减少是由于β细胞凋亡增加,增殖能力降低所致。β细胞凋亡可能系SPT和Caspase-3表达增加,Bcl-2表达下降所致。第四部分胰岛素治疗对高脂导致的DM大鼠β细胞功能障碍的作用及机制目的:胰岛素治疗对高脂导致的DM大鼠β细胞功能障碍的作用及可能的机制。方法:DM大鼠随机分为3组:DH组、DN组和DHI组,及NC组。DH组和DHI组大鼠高脂喂养,DN组和NC组大鼠给予正常饮食,DHI组大鼠同时给予胰岛素治疗。胰岛素治疗10周后,行OGTT及取胰腺组织,测定指标同第二、第三部分。结果:与DH组相比,DHI组大鼠经过胰岛素治疗后,血FFA和TG水平虽然没有明显改善,但是胰腺内的TG、FFA明显降低。胰岛素基因及蛋白表达和胰岛素含量增加,分别为DH组的4.41倍（P<0.01）、2.11（P<0.01）倍和1.47倍（P<0.05）;胰岛素分泌功能较DH组有所恢复,△I30/△G30和MBCI高于DH组（P<0.05～P<0.01）。同时相对β细胞数量和平均β细胞面积较DH组得以改善（P<0.01、P<0.05）;β细胞凋亡、SPT和Caspase-3基因的表达、Bcl-2和PCNA蛋白表达均较DH组改善（P<0.01～P<0.05）。结论:胰岛素治疗能改善高脂所致的DM大鼠β细胞功能障碍,且这种改善作用部分是与胰腺内的FFA和TG含量降低相关。
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