ipt基因表达载体的构建及其水稻遗传转化研究

论文摘要

植物叶片衰老是叶片发育的最后阶段。叶片衰老过程有着很重要的实际价值,因为当叶片衰老进行时,植物的营养成分可以转运到植物其它的生长部位,使营养物质得以再利用。然而在农业生产上,叶片衰老会带来不利影响,它将极大地限制作物产量潜力的发挥。水稻生育后期叶片过早衰老,导致同化能力降低,制约着水稻产量的进一步提高,细胞分裂素是一种重要的延缓植物叶片衰老进程的植物激素,ipt基因是细胞分裂素生物合成的关键酶基因,将叶片衰老特异表达的启动子PSAG12与ipt基因融合构成嵌合基因后再导入水稻中,可以特异性地提高转基因水稻体内的细胞分裂素水平,从而有效地延缓水稻叶片的衰老,为提高水稻的产量探索一条新的途径。本研究克隆了ipt基因及启动子PSAG12,并构建了适合水稻转化的表达载体,通过农杆菌介导法将其导入水稻并进行相应的分子检测,主要研究结果如下:1.以根癌土壤农杆菌C58 Ti质粒为模板,采取PCR方法,克隆了ipt基因,序列测定结果表明,插入片段全长723bp,包含了该基因完整的编码阅读框,与发表的ipt基因核苷酸同源性为100%（AE009419）。2.根据已知的PSAG12启动子序列设计引物,成功从拟南芥基因组中克隆SAG12基因5’侧翼1522bp启动子区域,与GenBank上公布的SAG12基因（ATU37336）的上游序列有99%的核苷酸序列同源性。3.通过一系列的酶切、电泳、目的片断的回收过程,将ipt基因和PSAG12启动子克隆到双元表达载体pCAMBIA1301上,构建出pCAMBIA1301-SAG12-ipt表达载体。4.通过冻融法将植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105,PCR筛选出阳性克隆,获得含有目的基因的工程菌。以水稻品种中花16和浙大H02-117的胚性愈伤为材料,进行农杆菌介导的遗传转化,通过潮霉素筛选,共获得37株抗性植株,经过PCR初步检测,4株为阳性植株,其中水稻品种中花16和浙大H02-117各2株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 植物叶片衰老
• 1.2 植物叶片衰老的特征和机理
• 1.3 影响植物叶片衰老的因素
• 1.3.1 外部因素
• 1.3.2 内部因素
• 1.4 叶片衰老与作物产量
• 1.5 细胞分裂素合成基因 ipt 及其基因工程研究进展
• 1.5.1 细胞分裂素的生物功能
• 1.5.2 异戊烯基转移酶（ IPT）简介
• 1.5.3 转异戊烯基转移酶基因的研究进展
• 1.6 水稻转基因方法的研究进展
• 1.6.1 花粉管通道法
• 1.6.2 基因枪法
• 1.6.3 PEG 法
• 1.6.4 电激法
• 1.6.5 农杆菌介导法
• 1.7 研究的目的意义及技术路线
• 1.7.1 研究的目的和意义
• 1.7.2 主要研究内容及技术路线
• 2 基因克隆及植物表达载体的构建
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 供试材料、质粒、菌株、试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常用试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 根癌农杆菌C58 Ti 质粒DNA 提取
• 2.2.2 拟南芥叶片基因组DNA 小量提取（修改的CTAB 法）
• 2.2.3 小量碱裂解法提取质粒
• 2.2.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备（TaKaRa Competent Cell Preparation Kit）
• 2.2.5 核酸的电泳及纯度、浓度测定
• 2.2.6 菌种保存
• 2.3 ipt 基因和 SAG12 启动子的克隆
• 2.3.1 ipt 基因的克隆
• 2.3.2 SAG12 基因启动子的克隆
• 2.3.3 DNA 片段快速回收（试剂盒采用OMEGA 公司产品）
• 2.3.4 DNA 连接
• 2.3.5 质粒DNA 的转化
• 2.3.6 重组质粒的PCR 和酶切鉴定
• 2.3.7 序列测定
• 2.4 植物双元表达载体的构建
• 2.4.1 pCAMBIA1301-ipt 中间载体的构建
• 2.4.2 pCAMBIA1301-SAG12-ipt 植物表达载体的构建
• 2.5 根癌农杆菌的转化
• 2.5.1 农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.5.2 农杆菌的PCR 鉴定
• 2.6 结果与分析
• 2.6.1 ipt 基因的扩增、克隆和测序
• 2.6.2 启动子的PCR 扩增、克隆和测序
• 2.6.3 pCAMBIA1301-ipt 载体的构建
• 2.6.4 pCAMBIA1301-SAG12-ipt 植物表达载体的构建
• 2.7 讨论
• 2.7.1 根癌农杆菌Ti 质粒的提取
• 2.7.2 基因和启动子的克隆
• 2.7.3 表达载体的构建
• 3 水稻遗传转化体系的建立
• 3.1 材料与试剂设备
• 3.1.1 生物材料
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 水稻愈伤组织的诱导
• 3.2.2 植株再生
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 愈伤组织的诱导
• 3.3.2 干燥处理对愈伤组织分化的影响
• 3.4 讨论
• 3.4.1 培养基对愈伤组织的影响
• 3.4.2 干燥处理对愈伤组织分化的影响
• 4 农杆菌介导法转化水稻
• 4.1 材料与试剂设备
• 4.1.1 供试材料、试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 农杆菌的培养
• 4.2.2 共培养
• 4.2.3 洗菌与选择
• 4.2.4 分化与生根
• 4.2.5 潮霉素本底抗性测定
• 4.2.6 转基因植株的分子检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 水稻胚性愈伤组织的获得
• 4.3.2 潮霉素本底抗性的测定
• 4.3.3 转基因水稻植株的获得
• 4.3.4 转基因植株的PCR 检测
• 4.4 讨论
• 4.4.1 转化受体
• 4.4.2 共培养时间对于转化的影响
• 4.4.3 选择标记
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 附件一：NB 培养基
• 附件二：N6 培养基