论文摘要
在植物识别病原物后激活防卫反应的过程中，转录因子起着重要的作用，它通过激活或抑制防卫基因的表达来实现防卫反应的调控。NAC转录因子是一个植物特有的庞大家族。最近研究表明，NAC转录因子在植物生长发育、激素应答及抗逆反应中起重要作用。本研究中，我分离鉴定了2个与拟南芥抗病反应相关的NAC型转录因子，其中一个是新鉴定的抗病相关NAC基因DRN1（defense-relatedNAC1），另一个是先前鉴定的抗逆相关NAC基因ATAF1，并研究了这两个NAC转录因子在抗病反应调控中的功能。在分析基因芯片数据中，发现DRN1基因在灰霉病菌（Botrytis incerea）、Pseudomonas syringae pv．tomato（Pst）DC3000侵染及水杨酸（salicylic acid，SA）、flg22等处理后上调表达，暗示DRN1可能与抗病反应有关。DRN1编码一个含275个氨基酸的蛋白，含有一个高度保守的NAC结构域。GFP融合蛋白分析显示，DRN1定位于细胞核内。转录激活活性分析结果表明，DRN1是一个转录激活因子，而且其转录激活区域位于C-端。promoter：：GUS染色结果显示，DRN1在正常拟南芥植株茎、叶、花内均有表达。RT-PCR分析结果表明，Pst DC3000和B．cinerea侵染后DRN1表达增强，其中24～48 hr时表达水平最为显著；SA、ACC（l-aminocyclopropane-1-carboxylic acid）和苯并噻二唑（benzothiadiazole，BTH）处理后均不同程度地诱导DRN1的表达。为了研究DRN1在抗病反应中的功能，筛选获得一个DRN1基因的T-DNA插入突变体drn1-1。在drn1-1植株中，RT-PCR检测不到DRN1基因表达，但是drn1-1对Pst DC3000和B．cinerea侵染仅有轻微的表型改变。考虑到NAC家族中基因冗余现象，构建了过量表达的chimeric repressor载体35S：：DRN1-SRDX和过量表达载体35S：：DRN1，并利用根癌农杆菌介导花序浸蘸法导入拟南芥中，分别获得7个35S：：DRN1和6个35S：：DRN1-SRDX的单拷贝株系，转代选取各3个纯合株系（DRN1-OE#2、#6和#11及DRN1-SRDX#1、#3和#8）。比较了野生型、drn1-1、DRN1-OE和DRN1-SRDX植株对B．cinerea、Pst DC3000和早疫病菌（Altenariabrassicicola）的抗病性变化。喷雾接种B．cinerea、注射接种Pst DC300或离体叶片滴注接种A．brassicicola后，drn1-1的发病略重于野生型，DRN1-SRDX#1、#3和#8植株病害明显重于野生型，而DRN1-OE#2、#6和#11植株上病害则显著轻于野生型。接种后，DRN1-SRDX#1、#3和#8植株叶片中B．cinerea生长量和PstDC3000菌量显著高于野生型对照，而DRN1-OE#2、#6和#11植株叶片中B．cinerea生长量和Pst DC3000菌量显著低于野生型对照。B．cinerea侵染后，DRN1-SRDX#1和#8植株中PR-1和PR-5基因表达上调，DRN1-OE#2和#11植株中PDF1．2和BIK1基因表达上调；而Pst DC3000侵染后，DRN1-SRDX#1和#8植株中PDF1．2基因表达上调，DRN1-OE#2和#11植株中PR-1和PR-5以及NPR1基因表达上调。此外，DRN1转基因拟南芥植株增强了对ABA的敏感性。这些结果表明，DRN1在拟南芥对不同类型病害的抗病反应中起正调控作用。ATAF1基因编码一个含289个氨基酸的蛋白，含有高度保守的NAC结构域。RT-PCR结果表明，B．cinerea和Pst DC3000侵染后，野生型植株中ATAF1表达受到抑制，表达水平逐渐下降；同样，SA、BTH、ACC和JA处理也不同程度抑制ATAF1的表达。在接种B．cinerea和Pst DC3000后，ATAF1的T-DNA插入突变体ataf1植株上病害水平略低于野生型，但不显著。为了克服NAC家族基因冗余引起功能研究上的困难，构建过量表达的chimeric repressor载体35S：：ATAF1-SRDX和过量表达载体35S：：ATAF1，利用根癌农杆菌介导花序浸蘸法导入拟南芥中，经转代筛选，分别获得2个35S：：ATAF1（ATAF1-OE#1和#7）和2个35S：：ATAF1-SRDX（ATAF1-SRDX#3和#10）的单拷贝株系。分析了野生型、ataf1、ATAF1-OE和ATAF1-SRDX植株对B．cinerea、Pst DC3000和A．brassicicola的抗病性变化。喷雾接种B．cinerea、注射接种Pst DC300或离体叶片滴注接种A．brassicicola后，ataf1的发病略轻于野生型，ATAF1-SRDX#3和#10植株病害症状明显轻于野生型，而ATAF1-OE#1和#7植株上病害则显著重于野生型。接种后，ATAF1-SRDX#3和#10植株叶片中B．cinerea生长量和Pst DC3000菌量显著低于野生型对照，而ATAF1-OE#1和#7植株叶片中B．cinerea生长量和Pst DC3000菌量显著高于野生量显著高于野生型对照。B．cinerea侵染后，ATAF1-SRDX#3和#10植株中PR-1、PR-5和NPR1基因表达上调，ATAF1-OE#1和#7植株中BIK1基因表达上调；而Pst DC3000侵染后，ATAF1-SRDX#3和#10植株中PR-1、PR-5和NPR1基因表达上调，ATAF1-OE#2和#11植株中PDF1．2基因表达上调。在灰霉菌侵染后，ATAF1-OE植株叶片中产生并积累了更多的活性氧，而在ATAF1-SRDX植株叶片中则仅有少量活性氧积累。这些结果表明，ATAF1在拟南芥对不同类型病害的抗病反应中起负调控作用。