商陆抗病毒蛋白抑制HBV复制的研究

论文摘要

第一部分全长及不同片段缺失型PAP基因真核表达质粒的构建目的:构建全长和不同片段缺失型PAP基因的真核表达质粒,为研究PAP抗HBV的活性区域奠定基础。方法:以含全长PAP基因的质粒PGEM-PAP为模板,设计3对引物,PCR扩增全长及不同片段缺失型PAP基因,TA克隆到pMD18-T载体中,经PCR、酶切、测序确证后,将它们用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,以正确读码框插入到经同样酶切的带有HA标签的真核表达载体pXF3H中,获得真核表达质粒pXF3H-PAP12、pXF3H-PAP14、pXF3H-PAP34。以PCR和酶切方法筛选鉴定阳性重组质粒并测序验证。结果:构建的全长及不同片段缺失型PAP基因的真核表达质粒经酶切鉴定和DNA测序,表明各基因正确地插入到真核表达载体pXF3H中,且密码子阅读框正确。结论:成功地构建了全长和不同片段缺失型PAP基因的真核表达质粒。第二部分全长PAP基因真核表达质粒体外抑制HBV复制的研究目的:了解全长PAP基因真核表达质粒在DNA水平、RNA水平、蛋白质水平体外对HBV的抑制作用。方法:利用脂质体将全长PAP基因真核表达质粒pXF3H-PAP12和具有复制能力的1.3倍HBV克隆pHBV1.3共转染HepG2细胞,转染72h后收集细胞及培养上清。Southernblot检测HBV核衣壳相关DNA含量,Northern blot检测HBV核衣壳相关RNA含量,ELISA检测细胞培养上清液HBsAg和HBeAg含量。结果:与pXF3H空载体对照组相比,0.5ug/ml、1.0ug/ml pXF3H-PAP12质粒对HBV核衣壳相关DNA的抑制率分别为38.0%（P﹤0.01）、74.0%（P﹤0.01）;对HBsAg的抑制率分别为76.8%（P﹤0.01）、99.7%（P﹤0.01）,对HBeAg的抑制率分别为72.7%（P﹤0.01）、99.3%（P﹤0.01）;1.0ug/ml pXF3H-PAP质粒对HBV核衣壳相关RNA的抑制率为69.0%（P﹤0.01）。结论:全长PAP基因真核表达质粒pXF3H-PAP12体外对HBV的病毒复制（DNA水平）和基因表达（RNA水平、蛋白质水平）均有抑制作用。第三部分天然PAP体内抑制HBV复制的研究目的:探讨天然PAP在急性HBV感染小鼠模型体内抗HBV的效果。方法:以液压法将具有复制能力的HBV质粒pAAV-HBV1.2通过尾静脉注射到免疫功能正常的BAL B/C小鼠体内,以建立急性HBV感染的小鼠模型。注射后第1天ELISA检测小鼠血清中HBsAg、HBeAg水平,根据HBsAg和HBeAg水平将35只小鼠配对,分成PAP治疗组和对照组（每组12只）。PAP治疗组予0.25mg/kg的PAP（对照组予生理盐水）腹腔注射,每日一次,连续7天。于PAP注射前、注射第1、3、5、7天后,ELISA检测小鼠血清中HBsAg、HBeAg、抗HBs、抗HBe水平,荧光定量PCR检测小鼠血清中HBV DNA水平。注射第7天后HE染色检测肝组织病理变化,免疫组化检测肝组织HBsAg和HBcAg表达情况。结果:35只小鼠注射pAAV-HBV1.2后,有30只（85.7%）小鼠在注射后第1天血清中可检测到HBsAg,另5只小鼠血清中始终未检测到HBsAg。小鼠血清中HBsAg和HBeAg在第1天表达达高峰,之后逐渐下降,第8天均未能检测到。小鼠血清中HBV DNA在第2天达高峰,之后仍维持在较高水平,至第8天时为1.9×104 copies/mL。与腹腔注射生理盐水组相比,PAP在腹腔注射后第1、3、5天对HBsAg的抑制率分别为23%（P﹤0.05）、47%（P﹤0.05）、68%（P﹤0.05）,对HBeAg的抑制率分别为36%（P﹤0.05）、55%（P﹤0.05）、83%（P﹤0.05）;PAP在腹腔注射后第1、3、5、7天对HBV DNA的抑制率分别为70.7%（P﹤0.05）、86.9%（P﹤0.05）、95.2%（P﹤0.05）、95.3%（P﹤0.05）,PAP也能抑制肝组织HBsAg和HBcAg的表达。结论:0.25mg/kg剂量的天然PAP在急性HBV感染小鼠模型体内对血清和肝组织的HBsAg、HBeAg的表达及HBV DNA的复制均有明显的抑制效果。第四部分全长及不同片段缺失型PAP基因真核表达质粒体外抗HBV的研究目的:比较全长和不同片段缺失型PAP基因真核表达质粒体外抗HBV作用及其细胞毒作用。方法:将全长PAP基因、缺失C端25个氨基酸的PAP基因、既缺失N端69个氨基酸又缺失C端25个氨基酸的PAP基因的真核表达质粒用脂质体转染HepG2 2.2.15细胞,转染72h后收集细胞及培养上清。ELISA检测细胞培养上清液HBsAg和HBeAg水平,荧光定量PCR检测培养上清HBV DNA水平,MTT比色法检测各质粒对转染的HepG2细胞毒性作用。结果:与pXF3H空载体对照组相比,2.0μg/ml pXF3H-PAP12、pXF3H-PAP14、pXF3H-PAP34质粒对HBsAg的抑制率分别为61.39%（P﹤0.05）、56.3%（P﹤0.05）、7.8%（P﹥0.05）,对HBeAg的抑制率分别为84.2%（P﹤0.05）、75.8%（P﹤0.05）、11.0%（P﹥0.05）;对HBV DNA的抑制率分别为63.2%（P﹤0.05）、61.7%（P﹤0.05）、20.5%（P﹤0.05）;MTT结果显示它们对细胞的抑制率分别为28.74%（P﹤0.05）、12.6%（P﹤0.05）、4.78%（P﹥0.05）。pXF3H-PAP14质粒对HBV的抑制作用与pXF3H-PAP12质粒相比无明显差异（P﹥0.05）,但细胞毒性作用明显低于pXF3H-PAP12（P﹤0.05）。pXF3H-PAP34质粒无细胞毒性作用,但其抗HBV作用也丧失。结论:PAP的C端25个氨基酸与细胞毒性相关,与抗HBV活性无关;PAP的N端69个氨基酸与抗HBV活性相关。

论文目录

• 前言
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 技术路线
• 正文
• 第一部分 全长及不同片段缺失型PAP 基因真核表达质粒的构建
• 一 前言
• 二 材料和方法
• 三 结果
• 附图
• 四 讨论
• 参考文献
• 第二部分 全长PAP 真核表达质粒体外抑制HBV 复制的研究
• 一 前言
• 二 材料和方法
• 三 结果
• 附图
• 四 讨论
• 参考文献
• 第三部分 天然PAP 体内抑制HBV 复制的研究
• 一 前言
• 二 材料和方法
• 三 结果
• 四 讨论
• 参考文献
• 第四部分 全长及不同片段缺失型PAP 基因真核表达质粒体外抗HBV的研究
• 一 前言
• 二 材料和方法
• 三 结果
• 附图
• 四 讨论
• 参考文献
• 总结和展望
• 综述
• 英文缩写词及中文对照
• 附录
• 致谢