棉铃虫和烟夜蛾生殖生物学特性比较研究

论文摘要

棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）和烟夜蛾Helicoverpa assulta（Guenée）是铃夜蛾属两近缘种昆虫,二者具有相似的生物学和生态学习性,甚至杂交可育,但它们的寄主范围却截然不同,棉铃虫是多食性昆虫,烟夜蛾则是典型的寡食性昆虫。有关棉铃虫和烟夜蛾的比较研究很多,但系统研究两种夜蛾生殖行为和生殖生理等差异方面的内容还未见报道。本试验从行为、形态和生理上等方面对棉铃虫和烟夜蛾的生殖生物学特性进行了一系列比较研究,主要结果如下:1.两种夜蛾的生殖行为:（1）两种夜蛾雌蛾或雄蛾的交配能力之间均无显著差异;3日龄蛾的交配率较高,6日龄前棉铃虫的交配率均显著高于烟夜蛾;不同蛾龄下烟夜蛾的交配持续时间均显著长于棉铃虫,且随着交配蛾龄的增加而逐渐延长;两种夜蛾交配高峰出现的时间明显不同,棉铃虫交配高峰在凌晨4:006:00,而烟夜蛾交配高峰在0:002:00。（2）1日龄交配的棉铃虫和烟夜蛾,其产卵前期分别为2.5和3.6 d;不同交配蛾龄棉铃虫的产卵前期均显著短于烟夜蛾,但其寿命均长于烟夜蛾;不同蛾龄棉铃虫卵的孵化率均显著高于烟夜蛾;两种夜蛾的产卵期和产卵量之间存在显著差异,二者3日龄前的产卵量相对较高,且棉铃虫的产卵量显著高于烟夜蛾。2.不同发育阶段两种夜蛾的雌、雄性内生殖器官在形态上基本相似。随着虫龄的增加,中输卵管、侧输卵管和卵巢管的长度也相应增加。不同发育时期棉铃虫的中输卵管和侧输卵管长度均显著长于烟夜蛾;不同发育时期棉铃虫交配囊茎长度和交配囊体宽度均大于烟夜蛾,但无显著差异;不同发育时期棉铃虫交配囊体均显著长于烟夜蛾。但随着虫龄的增加,精巢的直径却相应降低,且不同发育时期棉铃虫的精巢直径均显著大于烟夜蛾。3.两种夜蛾内生殖器官可溶性总糖和蛋白质的含量:随着虫龄的增加,棉铃虫和烟夜蛾雄性内生殖器官和附腺内可溶性总糖和蛋白质含量也增加,且不同发育时期两种夜蛾之间均存在显著性差异;交配后雄性内生殖器官可溶性总糖和蛋白质含量较交配前有显著增加,但交配后附腺内的可溶性总糖含量较交配前却显著降低;棉铃虫和烟夜蛾3日龄未交配成虫雌性内生殖器官蛋白质含量分别为94.30和81.89μg/mg,交配后蛋白质含量又显著增加到135.96和112.24μg/mg,是3日龄未交配成虫蛋白质含量的1.44和1.37倍,且不同发育时期棉铃虫雌性内生殖器官的可溶性蛋白含量均显著大于烟夜蛾。4.烟夜蛾组织蛋白酶L的克隆、序列分析与原核表达:本研究利用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）和3’RACE技术从烟夜蛾HeLicoverpa assulta雌蛾卵巢中扩增得到了组织蛋白酶L（cathepsin L,CL）cDNA片段,将其克隆至pMD19-T载体,测序结果表明,该片段长度为1383 bp（GenBank登录号为JN017204）,含有组织蛋白酶L酶原基因完整开放阅读框架（ORF）。序列分析结果显示,烟夜蛾组织蛋白酶L（HassCL）编码341个氨基酸残基,预测HassCL蛋白的N-末端含有长度为16个氨基酸残基的信号肽序列,去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为36.2kDa,等电点为6.01。氨基酸序列比对结果表明,HassCL与其它昆虫的组织蛋白酶L氨基酸序列具有较高的一致性。将去除信号肽序列的HassCL重组到表达载体pGEX-4T-2中,并转入原核细胞中表达,SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导后,该基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约62 kDa的目的条带,与预测的融合蛋白分子量相符。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 棉铃虫和烟夜蛾
• 1.1.1 分布与寄主植物
• 1.1.1.1 棉铃虫
• 1.1.1.2 烟夜蛾
• 1.1.2 亲缘性比较
• 1.1.2.1 幼虫表皮碳氢化合物
• 1.1.2.2 雌性信息素
• 1.1.2.3 酯酶
• 1.1.2.4 对植物次生代谢的反应
• 1.1.2.5 杂交可育性
• 1.1.2.6 在烟草上的生态位及种间竞争
• 1.2 昆虫的交配和产卵行为
• 1.2.1 交配
• 1.2.2 授精
• 1.2.3 受精
• 1.2.4 交配对昆虫生殖系统营养物质的影响
• 1.2.5 温度、光照等对昆虫成虫寿命、交配及繁殖的影响
• 1.2.6 多次交配对昆虫繁殖适度的影响
• 1.2.7 延迟交配对昆虫繁殖适度的影响
• 1.2.8 日龄对昆虫繁殖适度的影响
• 1.3 组织蛋白酶L
• 1.3.1 蛋白酶分类及组织蛋白酶
• 1.3.2 组织蛋白酶的结构
• 1.3.3 组织蛋白酶的功能
• 1.3.3.1 组织蛋白酶对蛋白前体的加工激活作用
• 1.3.3.2 组织蛋白酶在抗原呈递及免疫应答中的作用
• 1.3.3.3 组织蛋白酶在发育过程中的作用
• 1.3.3.4 组织蛋白酶在病理过程中的作用
• 1.3.4 组织蛋白酶L 研究意义及展望
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 棉铃虫和烟夜蛾的生殖行为
• 3.1.1 供试昆虫及饲养方法
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 棉铃虫和烟夜蛾交配次数的观察
• 3.1.2.2 棉铃虫和烟夜蛾交配行为的观察
• 3.1.2.3 棉铃虫和烟夜蛾产卵行为的观察
• 3.1.3 数据的统计分析
• 3.2 棉铃虫和烟夜蛾内生殖器官及其发育进度
• 3.2.1 供试昆虫
• 3.2.2 仪器与用具
• 3.2.3 试验方法
• 3.2.3.1 雌性内生殖器官解剖
• 3.2.3.2 雄性内生殖器官解剖
• 3.2.4 数据的统计分析
• 3.3 棉铃虫和烟夜蛾内生殖器官内营养物质含量测定
• 3.3.1 供试昆虫
• 3.3.2 试剂及仪器
• 3.3.2.1 试剂
• 3.3.2.2 仪器
• 3.3.3 试验方法
• 3.3.3.1 棉铃虫和烟夜蛾内生殖器官的解剖
• 3.3.3.2 蛋白标准曲线的制作
• 3.3.3.3 可溶性糖标准曲线的制作
• 3.3.3.4 蛋白质含量和可溶性总糖的测定
• 3.4 烟夜蛾组织蛋白酶L 的克隆、序列分析与原核表达
• 3.4.1 供试昆虫
• 3.4.2 仪器设备
• 3.4.3 主要试剂
• 3.4.3.1 菌株及质粒
• 3.4.3.2 主要试剂盒及工具酶
• 3.4.3.3 缓冲溶液
• 3.4.3.4 培养基
• 3.4.3.5 SDS- PAGE 电泳试剂
• 3.4.3.6 Western blot 所用溶液
• 3.4.3.7 其它溶液
• 3.4.4 试验方法
• 3.4.4.1 卵巢总RNA 的提取
• 3.4.4.2 反转录
• 3.4.4.3 引物设计
• 3.4.4.4 RT-PCR
• 3.4.4.5 PCR 产物的克隆和鉴定
• 3.4.4.6 3’RACE
• 3.4.4.7 序列测定和分析
• 3.4.4.8 去除信号肽序列的烟夜蛾组织蛋白酶L（HassCL）原核表达载体的构建
• 3.4.4.9 外源基因的诱导表达
• 3.4.4.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western 印迹分析
• 3.4.4.11 融合蛋白可溶性检测
• 4 结果与分析
• 4.1 棉铃虫和烟夜蛾生殖行为的差异
• 4.1.1 棉铃虫和烟夜蛾的交配能力
• 4.1.2 不同蛾龄下两种夜蛾的交配率
• 4.1.3 两种夜蛾交配的昼夜节律
• 4.1.4 不同蛾龄棉铃虫和烟夜蛾的交配持续时间
• 4.1.5 不同蛾龄棉铃虫和烟夜蛾的产卵行为
• 4.2 棉铃虫和烟夜蛾内生殖器官及其发育进度的差异
• 4.2.1 不同发育阶段棉铃虫和烟夜蛾雌性内生殖器官比较
• 4.2.2 不同发育阶段棉铃虫和烟夜蛾雄性内生殖器官比较
• 4.3 棉铃虫和烟夜蛾内生殖器官中营养物质含量的差异
• 4.3.1 不同发育时期棉铃虫和烟夜蛾雄性内生殖器官中可溶性总糖和蛋白质含量的变化
• 4.3.2 不同发育时期棉铃虫和烟夜蛾雌性内生殖器官中可溶性总糖和蛋白质含量的变化
• 4.4 烟夜蛾组织蛋白酶L 的克隆、序列分析与原核表达
• 4.4.1 烟夜蛾组织蛋白酶 L（HassCL）的扩增、克隆和序列测定
• 4.4.2 序列分析
• 4.4.3 去掉信号肽的烟夜蛾组织蛋白酶L（HassCL）在大肠杆菌中的表达与检测
• 4.4.4 表达蛋白的可溶性检测
• 5 结论与讨论
• 5.1 棉铃虫和烟夜蛾生殖行为的差异
• 5.2 棉铃虫和烟夜蛾生殖系统及其发育进度差异
• 5.3 棉铃虫和烟夜蛾内生殖器官中营养物质含量的差异
• 5.4 烟夜蛾组织蛋白酶L 的克隆、序列分析与原核表达
• 参考文献
• ABSTRACT
• 硕士期间已发表与待发表的论文