去细胞猪主动脉瓣RGD表面修饰促进细胞粘附的实验研究

论文摘要

对于心脏瓣膜疾病最为主要的治疗方式仍是手术进行瓣膜置换。目前临床应用的人工心脏瓣膜有机械瓣和生物瓣两大类,尽管均能改善和延长患者的生命,但都未达到理想程度。机械瓣需要终生抗凝,有一定的栓塞和出血率;生物瓣则存在衰坏、钙化的问题。同种瓣膜虽优于异种生物瓣,但来源受限,并且也存在衰败的问题。研究与开发组织工程心脏瓣膜是当前大势所趋。利用去细胞瓣构建组织工程心脏瓣膜,具有任何高分子可降解材料无法替代的优越性。但是由于在支架材料的去细胞过程中,会同时去除大量细胞外可溶性基质,其中包括已知的调控细胞粘附的蛋白分子。因此在利用去细胞瓣构建组织工程心脏瓣膜时,如何调控、促进种子细胞的粘附、增殖和ECM新生,是丞待解决的重要问题。借鉴目前对于“生物惰性材料”通过“表面修饰”的方式,可以改善或提高其生物相容性、材料的理化性能的成功经验,拟对去细胞瓣进行表面修饰,以改善其理化性能、促进种子细胞的粘附、增殖和分化。生物活性分子RGD肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）作为天然ECM重要组成,是目前应用最广、最有效的促进细胞粘附的多肽。本研究首先通过应用我们实验室筛选的,胰蛋白酶+TritonX-100法制备去细胞猪主动脉瓣支架,并对本实验室筛选的交联剂-环氧氯丙烷处理去细胞瓣膜支架材料的影响进行进一步的对比研究。在此基础上,应用多肽（序列为YGRGDSP酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸）与环氧氯丙烷联合对去细胞猪主动脉瓣膜进行表面修饰,并研究处理后材料细胞粘附性的变化。对去细胞支架材料的改良,以及通过交联RGD进行表面修饰做了初步的尝试。第一部分去细胞猪主动脉瓣膜的制备及环氧氯丙烷改性后的理化性能实验。采用胰蛋白酶消化和高渗、低渗性去垢剂TritonX-100漂洗的方法制备去细胞猪主动脉瓣,分别用GA、EC以及GA+EC（GE）的方法处理去细胞猪主动脉瓣,比较相互之间力学、组织稳定性、组织相容性上的差异。结果1、采用胰酶+TritonX-100法能完全脱除猪主动脉瓣膜的细胞成分。2、GA、EC以及GE三种处理方法,均可使APAV在力学、热皱缩温度、体外抗酶解能力上得到加强,并且其中以GE效果最佳。3、动物皮下包埋、血浆蛋白及血小板粘附实验结果表明,EC处理不改变APAV的组织相容性和血液相容性,同时经EC处理的GA组APAV,显著的降低GA的生物毒性,其组织相容性、血液相容性明显优于GA处理组。结论本实验提示GE处理APAV,能够明显改善APAV理化性质,降低GA的生物毒性,有利于提高组织相和血液相容性。第二部分环氧氯丙烷联合RGD对去细胞猪主动脉瓣修饰的实验研究。目的研究含RGD肽表面修饰的去细胞瓣对细胞粘附性的影响。方法各不同处理去细胞瓣组与YGRGDSP肽反应,通过茚三酮法、荧光标记显示法比较各组的结合率。种植大鼠主动脉MFBs,沉淀法检测细胞粘附率。结果茚三酮、荧光显像法各组对比显示多肽可很好的交联到EC、GE组,最佳反应条件为:室温,1.5mg/ml RGD、pH7.4、持续振荡12h。经RGD肽修饰的EC、GE组细胞粘附率较单纯APAV显著提高。结论利用EC,可将YGRGDSP肽以共价接枝的方式固定到去细胞猪主动脉瓣支架进行表面修饰,EC联合RGD肽表面修饰去细胞瓣可显著改善细胞粘附性。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 生物材料表面固定蛋白质进行表面修饰
• 2 在生物材料表面固定氨基酸及其衍生物进行表面修饰
• 3 在生物材料表面固定多肽进行表面修饰
• 4 生物材料的表面结构特征修饰
• 5 利用微模型技术（micropatterning） 对生物材料进行表面修饰
• 小结
• 正文
• 第一部分 去细胞猪主动脉瓣膜的制备及环氧氯丙烷改性后的理化性能和生物相容性实验
• 1 材料和试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 环氧氯丙烷联合RGD对去细胞猪主动脉瓣修饰的实验研究
• 实验一 线性多肽的合成和检测
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验二 RGD与去细胞瓣的共价连接实验
• 1 材料和试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 去细胞猪主动脉瓣RGD表面修饰对细胞粘附影响的实验
• 1 材料和试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢