斑马鱼药源性耳毒模型的建立及应用

论文摘要

婴幼儿的听力障碍是最常见的出生缺陷,在我国位居5项残疾之首。第二次全国残疾人抽样调查显示,我国儿童听力残疾患者约占总听力残疾人数的10%,且数量目前还在以每年2万～4万人的速度递增。婴儿出生后6个月～1岁,是语言发育的最关键时期,听力障碍在婴儿期较隐匿,如果不能及时发现和干预将严重影响患儿的言语、认知及情感发育。在诸多造成听力损伤的因素中,药源性耳聋被认为是听力损伤的主要成因之一。然而目前药物的耳毒性预测系统和检测技术并不能满足新药研发和药物安全性评价的需求。本文通过研究具有耳毒性的三种氨基糖苷类抗生素庆大霉素（Gentamycin）、新霉素（Neomycin）和链霉素（Streptomycin）对斑马鱼幼体毛细胞的损伤作用,以及与听力相关基因表达的相关性,建立了一种可简便、灵敏、快速、直观地检测药物耳毒性的斑马鱼模型和方法。在此基础上应用三种头孢类抗生素——头孢噻肟（Cefotaxime Sodium）、头孢唑啉（Cefazolin Sodium）和头孢丙烯（cis-Cefprozil）以及一种头孢类杂质——反式头孢丙烯（trans-Cefprozil）对该模型进行了进一步的验证,以探索所建模型的有效性。本研究的主要结果如下：（1）通过对已知具有明确耳毒性作用的三种氨基糖苷类抗生素的研究,建立了斑马鱼的药源性耳毒模型,该模型的检测标准为：（1）斑马鱼的耳囊结构发育出现异常；（2）耳囊周围的五个部位（MI1、MI2、01、02、I04）的神经丘毛细胞出现数量减少,或者耳囊或侧线的神经丘毛细胞出现整体缺失；（3）48 hpf胚胎与听力发育相关的基因表达水平出现下调或上调;（4）5 dpf斑马鱼幼鱼在静止状态下背轴出现弯曲。前两个指标为必要检测终点。（2）利用所建立的模型,对四种可能与氨基糖苷类抗生素具有不同耳毒性机理的头孢菌素的耳毒性进行了评价。四种头孢类化合物的致畸及致死强度依次为：头孢唑啉>反式头孢丙烯>顺式头孢丙烯>头孢噻肟。这四种头孢类化合物对斑马鱼的毒性作用均表现出体轴、心脏及卵黄囊发育异常,具体来说主要是发育滞后,躯干弯曲,色素异常,围心囊膨大,腹侧近心主静脉淤血；且这四种化合物对斑马鱼的耳囊结构均可造成不可逆的变化,包括椭圆囊形态变异（球形化）或消失,球囊变小,以及两者间距变大和半规管结构异常；同时均造成耳囊周围和侧线毛细胞数量甚至神经丘减少或缺失,该现象具有浓度依赖性,且呈现出显著性差异。（3）在基因水平上,这四种化合物均造成多个听力相关基因的表达量下调,其中有共同的基因,也有不同的基因,说明听力损伤是多个基因共同作用的结果。这些基因变化的内在联系有待进一步研究。在所建立的模型中,氨基糖苷类与头孢类抗生素对斑马鱼神经丘和毛细胞死亡损伤情况相同；但涉及的靶基因有差异,这不仅证明了文献中报道的这两类抗生素在动物实验中的耳毒性作用机制不同的结论,也进一步验证了我们所建立模型的有效性。

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中文摘要

Abstract

引言

一、应用三种氨基糖苷类药物建立斑马鱼耳毒检测模型

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

实验结果与讨论

3 实验结果

4 讨论

二、四种头孢类化合物对斑马鱼耳毒模型的验证