论文摘要
细菌中锌离子的平衡主要是通过调控Zn2+吸收系统和Zn2+排放系统的表达来维持的。长期以来一直认为,细菌的金属离子吸收系统和排放系统是由不同的调控蛋白分开调控的。众所周知,Zur蛋白的主要功能是负调控Zn2+吸收系统的表达。但是,在十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestrispv.campestris,简称Xcc）中,zur突变体对高浓度Zn2+敏感、EPS产量下降和致病力降低,表明在Xcc中,Zur不但调控Zn2+平衡,还与EPS产生和致病性相关（Tang et al,MPMI Vol.18,No.7,2005,pp.652-658.）。为了研究Xcc中Zur蛋白在调控锌平衡方面的真正功能,我们用DNA芯片分析的方法鉴定出在锌丰富条件下Zur的调控元。芯片结果表明,在锌丰富条件下,有38个基因受Zur负调控,而有29个基因受Zur正调控。通过构建基因启动子与gusA基因转录融合的报告质粒检测表明芯片结果是可靠的。对这67个受Zur调控的基因进行生物信息学分析,我们推测XC0266-XC0267,XC2471-XC2472-XC2473和XC3786-XC3787-XC3788可能分别编码三个Zn2+吸收系统,而XC2976可能编码一个Zn2+排放泵。对这些Zn2+平衡相关基因的启动子与gusA基因转录融合的报告质粒在野生型背景下的GUS活性检测表明,三个假定的Zn2+吸收系统的表达均受低Zn2+浓度诱导,受高Zn2+浓度抑制,而假定的Zn2+排放泵受低Zn2+浓度抑制,受高Zn2+浓度诱导。而所有这些Zn2+平衡相关基因的报告质粒在zur突变体背景下的GUS活性不受Zn2+浓度影响,说明Zn2+浓度对这些基因的诱导依赖于Zur蛋白。为了鉴定这些基因在Zn2+平衡方面的功能,我们构建了这些基因的突变体并检测假定的Zn2+吸收系统的基因突变体在低Zn2+浓度下生长情况,而检测假定的Zn2+排放泵的基因突变体在高Zn2+浓度下生长情况。结果表明,所有假定的Zn2+吸收系统的基因突变体在低Zn2+浓度培养基中的生长均比野生型菌株差,但加入一定浓度的Zn2+又使突变体的生长恢复到野生型水平,这些结果表明,XC0266-XC0267,XC2471-XC2472-XC2473和XC3786-XC3787-XC3788可能分别编码三个Zn2+吸收系统。XC2976基因突变体在高Zn2+浓度条件下生长比野生型菌株差,且XC2976的产物与已鉴定的一个Zn2+排放泵,Ralstonia的CzcD,在序列和结构上很相似,表明XC2976编码一个CDF型Zn2+排放泵。对基因启动子与gusA基因转录融合报告质粒的GUS活性检测表明,在Xcc中,Zur不但负调控三个假定的Zn2+吸收系统的表达,还正调控一个Zn2+排放泵的表达。为了检测Zur蛋白是否直接调控这些基因的表达,我们用EMSA检测Zur与这些基因的启动子在体外的结合情况。结果表明,Xcc的Zur蛋白不仅能与Zn2+吸收系统的启动子结合,而且能与Zn2+排放泵的启动子结合,且Zur与它们的结合需要Zn2+,说明Zur直接调控这些基因的表达。为了证明Zur确实直接激活Zn2+排放泵的转录和直接抑制Zn2+吸收系统的转录,我们进行体外转录实验。结果表明,XC0267、XC2471-2和XC3788的转录随Zur蛋白的增加而减少,而XC2976的转录随Zur蛋白的增加而增加,证明Zur蛋白直接抑制XC0267、XC2471-2和XC3788的转录而直接激活XC2976的转录。为了确定Zur结合在这些基因启动子区的序列,我们进行DNaseI足迹试验。结果表明,Xcc的Zur蛋白结合在假定的Zn2+吸收系统启动子区的序列是一段约30 bp的与Ecoli的Zur-box相似的保守序列,而结合在Zn2+排放泵的启动子区的序列是一段59 bp的富含GC的序列,该序列有一个20 bp的反向重复序列。序列比对表明Zur结合在Zn2+排放泵启动子区的序列与结合在假定的Zn2+吸收系统启动子区的序列相似性极低,表明在Xcc中,Zur能识别两个完全不同的序列。用5’-RACE方法确定Zn2+平衡相关基因的转录起始位点后发现,Xcc的Zur蛋白均结合在这些Zn2+平衡相关基因启动子的-10和-35区。zur突变体与Zn2+排放泵的突变体对高Zn2+浓度的敏感程度及细胞内聚集的锌含量基本一致,表明zur突变体对高浓度Zn2+敏感是由于Zn2+排放泵的功能缺失引起的。所有Zn2+平衡相关基因的致病性和EPS产量与野生型菌株一致,说明Xcc中Zur蛋白调控Zn2+敏感性是独立于致病性和EPS产生的。为了研究Xcc中,Zur蛋白在调控致病性方面的功能,我们用DNA芯片分析的方法鉴定出在基本培养基MMX（大多数致病相关基因受诱导表达）条件下Zur的调控元。芯片结果显示,在MMX培养条件下,有149个基因受Zur负调控,而有216个基因受Zur正调控。在216个受Zur正调控的基因中,几乎包括所有的hrp基因,表明zur突变体致病力的下降可能是由于hrp基因的表达下降引起的。RT-PCR检测进一步证实了zur突变体中hrp基因的表达是下降的。通过检测所有hrp基因的启动子与gusA基因转录融合的报告质粒在野生型菌株Xcc 8004和在zur突变体中的GUS活性,我们发现Zur蛋白出除了正调控hrp基因簇外,还调控hrpX,但不调控hrpG。说明Zur通过hrpX调控hrp基因簇的表达。Zur不能与hrpX的启动子结合,说明Zur可能间接调控hrpX的表达。为了进一步证实Zur通过hrpX调控hrp基因簇,我们构建了组成型表达的hrpX并导入到zur突变体中。HR和致病性检测结果表明,组成型表达的hrpX能使zur突变体延迟的HR恢复到野生型水平,且能使zur突变体的致病力得到部分恢复,说明Zur通过hrpX调控hrp基因簇的表达。组成型表达的hrpX仅部分恢复zur突变体的致病力说明除hrp基因外,Zur还调控其它致病相关基因的表达。
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