论文摘要
实验目的脑卒中是当今人类第三大死亡疾病和首位的致残原因,在我国脑卒中已经连续数年成为第二位的死亡原因,每年存活的脑卒中患者数600～700万,80%以上属于缺血性脑卒中。缺血性脑组织内部和周围存在大量炎症细胞和炎症介质,尽管炎症在组织修复中具有非常重要的作用,但随着对炎症细胞和炎症介质在缺血性脑损伤中的作用研究的深入,人们发现炎症能导致继发性神经元损伤,因此消除或抑制炎症就成为治疗缺血性脑损伤的策略之一。作为作用最强大和起效最快的抗炎药物,糖皮质激素在缺血性脑血管病中的应用一直存在着很大的分歧:一方面,糖皮质激素可缩小梗死体积、减轻水肿、提高脑血供,进而发挥一定的脑保护作用;另一方面,缺血性应激过程中内源性糖皮质激素或药理剂量的糖皮质激素又会对缺血性脑损伤后的神经元产生毒性作用,特别是促进缺血后海马神经元凋亡。究竟糖皮质激素在脑卒中中作用如何,能否减轻糖皮质激素对海马神经元的神经毒性而又不影响糖皮质激素的脑保护作用呢?本实验旨在观察温补肾阳,阴阳互济的方药右归饮能否在不影响糖皮质激素脑保护作用的前提下抑制糖皮质激素对海马神经元的神经毒性。本项研究将为临床使用右归饮来抑制糖皮质激素的神经毒性提供实验依据,探索糖皮质激素在缺血性脑血管病中的应用条件。同时,本项研究还将探讨右归饮在减轻缺血性应激过程中内源性糖皮质激素引起的海马神经元损伤时对脑缺血灶的影响情况,为临床上如何使用右归饮治疗应激水平的内源性糖皮质激素引起的海马神经元损伤提供实验依据。本项研究还将为临床上运用温补肾阳,阴阳互济方法治疗脑缺血后海马神经元凋亡提供理论依据,具有较大的理论及临床价值。实验方法实验主要分为三个部分:1、采用大脑中动脉阻塞（MCAO）模型,进行行为学观察并评分;大脑取材后一部分用TTC染色法,观察糖皮质激素地塞米松对梗死灶体积的影响,以及右归饮对此的干预作用;另一部分取海马进行组纵切片,HE染色观察。2、第一部分实验的海马切片用原位末端TUNEL标记法,标记海马凋亡细胞;用免疫组化法检测海马凋亡相关基因蛋白的表达,观察地塞米松对这些指标的影响,以及右归饮对其的干预作用,以观察右归饮减轻糖皮质激素所致的海马神经元损伤的作用及机制。3、体外培养海马神经元,用倒置显微镜进行形态学观察,用免疫组化方法鉴定海马神经元纯度,通过MTT法检测海马神经元存活率;缺糖缺氧2h再复糖复氧24h模拟体外培养的脑缺血模型,用免疫组化法检测各组海马神经元凋亡相关基因蛋白的表达,结合钙离子图像等技术,观察右归饮药物血清对糖皮质激素及兴奋性氨基酸等引起海马神经元细胞内游离钙离子浓度升高的作用及机制,并观察右归饮药物血清对糖皮质激素引起海马神经元凋亡的作用及机制。实验结果1、行为学评分:治疗2组（地塞米松+右归饮组）和治疗3组（右归饮组）之间无明显差异,但它们分别与模型组和治疗1组（地塞米松组）之间有明显差异,同时治疗3组与治疗2组比较大鼠的行为学改变有所减轻。2、梗死体积测定:模型组和治疗1组的脑梗死体积比存在明显差异;治疗2组和治疗3组的脑梗死体积比无明显差异;治疗2组和治疗3组的脑梗死体积比与模型组和治疗1组分别比较下降明显。3、海马切片组织学观察与海马神经元密度计算:缺血再灌注24小时后,模型组和治疗1、2、3组均可见大鼠海马CA1区段锥体细胞程度不等的胞浆肿胀及核固缩。齿状回锥体细胞部分出现严重肿胀,核染色质浓缩,核膜界限不清。治疗2、3组的改变明显轻于模型组和治疗1组,治疗2组、3组的海马神经元存活率显著高于模型组和治疗1组。4、海马切片凋亡细胞的观察:正常组与假手术组海马组织可见少量阳性细胞,模型组及3个治疗组凋亡细胞散布于整个海马组织。模型组和治疗1组的阳性细胞数多于治疗2、3组,存在统计学差异,治疗2组的阳性细胞数明显少于治疗1组,两者之间存在统计学的差异。5、海马切片免疫组化检测:Bcl-2蛋白检测:模型组、治疗1组分别与正常组及假手术组比较Bcl-2蛋白阳性细胞数目增多;治疗2、3组均可增加脑缺血再灌注诱导的Bcl-2蛋白阳性细胞数目,与模型组及治疗1组比较有显著性差异。Bax蛋白检测:模型组与假手术组比较Bax蛋白阳性细胞数目增多;治疗2、3组均可减少脑缺血再灌注诱导的Bax蛋白阳性细胞数目,与模型组和治疗1组比较有显著性差异。Caspase-3蛋白检测:模型组与治疗1组分别和正常组及假手术组比较Caspase-3蛋白阳性细胞数目增多;治疗2、3组均可减少脑缺血再灌注诱导的Caspase-3蛋白阳性细胞数目,与模型组和治疗1组比较有显著性差异6、原代海马神经元的培养和鉴定:选用出生24h内的SD大鼠,无菌分离并培养海马神经元,培养至第6天,经NSE免疫组化染色鉴定,海马神经元占细胞总数的91%以上。7、MTT法测定海马神经元活性:模型组的细胞存活率比正常组显著降低,1组（地塞米松组）与2组（地塞米松+空白血清）之间的细胞存活率无明显差异,1组与2组均明显低于正常组和模型组;3组（右归饮+地塞米松组）的细胞存活率明显高于2组;4组（右归饮组）细胞存活率明显高于模型组及2组和3组。8、海马神经元免疫组化检测:Bcl-2蛋白检测:模型组、1组分别与正常组比较Bcl-2蛋白阳性细胞数目增多;1组、2组之间无明显差别;3、4组均可增加脑缺血再灌注诱导的Bcl-2蛋白阳性细胞数目,分别与模型组及2组比较有显著性差异Bax蛋白检测:模型组与正常组比较Bax蛋白阳性细胞数目增多;1组、2组之间无明显差别;3、4组均可减少大鼠脑缺血再灌注诱导的Bax蛋白阳性细胞数目,分别与模型组和2组比较有显著性差异。Caspase-3蛋白检测:模型组与1组分别和正常组比较Caspase-3蛋白表达阳性细胞数目增多;1组与2组之间无明显差别;3、4组均可减少大鼠脑缺血再灌注诱导的Caspase-3蛋白阳性细胞数目,与模型组和2组比较有显著性差异。9、海马神经元细胞内游离钙离子浓度(Ca2+)测定:与正常组相比,缺糖缺氧/复糖复氧模型组细胞内Ca2+浓度显著增高;1组、2组之间细胞内游离Ca2+浓度无明显差异;1组与2组细胞内游离Ca2+浓度均明显高于正常组和模型组;3组细胞内游离Ca2+浓度明显低于2组;4组细胞游离Ca2+浓度低于模型组及2、3组。实验结论1、脑缺血再灌注导致大鼠海马神经元Bax、Caspase-3蛋白表达增加,改变了线粒体膜的通透性,导致细胞色素C的释放,促使细胞凋亡。2、脑缺血时应激所致的高糖皮质激素水平在脑缺血再灌注海马损伤中起重要作用,其可能的机制部分在于糖皮质激素通过间接激活细胞膜钙通道,促进钙内流,导致海马神经元内钙超载;同时下调脑缺血再灌注后大鼠海马神经元Bcl-2蛋白的表达,使Bax的表达更占优势,Bcl-2/Bax比值降低,抑制了Bcl-2对细胞的保护作用,间接的促进了凋亡。3、脑缺血再灌注的急性期给予糖皮质激素并不能改善脑缺血症状,相反能加重神经元损伤,临床使用糖皮质激素治疗脑缺血需要慎重。在脑缺血稍晚期必要时小剂量使用,以发挥其抗炎和降低脑水肿的作用。4、右归饮可以维持海马神经元钙稳态,同时通过上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax、Caspase-3表达,从而对抗脑缺血再灌注和/或地塞米松的损伤,保护海马神经元的存活。
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