斑马鱼血液发育候选基因loc558117的功能研究

论文摘要

血细胞发育是一个错综复杂的过程,受一系列转录因子调控。目前虽然已经鉴定出一些血细胞发育转录调控因子,但仍有很多血细胞发育调控基因有待鉴定,其分子调控机制有待深入研究。斑马鱼和哺乳类造血系统的信号调控通路高度进化保守。斑马鱼以其独特的优势成为进行脊椎动物发育生物学研究的理想模式动物之一。TRIM45是我室克隆鉴定的一个与血细胞发育有关的候选基因,本文利用斑马鱼模型研究TRIM45基因的功能。loc558117基因是TRIM45在斑马鱼中的同源基因,有一个环型锌指,两个B盒型锌指,一个α-螺旋卷曲螺旋结构域。半定量RT-PCR证明敲低loc558117基因的表达,血细胞发育标志基因TRIM33、SMAD5、GATA2、BMP2B等的mRNA表达水平下调,说明loc558117与斑马鱼血细胞发育相关。利用制备的地高辛标记的loc558117反义RNA探针,分别对斑马鱼各个发育时期的胚胎进行原位杂交。分析结果表明,loc558117的mRNA在斑马鱼发育各时期均有表达。为了研究其蛋白表达,利用PCR技术扩增斑马鱼loc558117基因编码区的491bp片段,将其插入到原核表达载体pET-28a中,构建成表达重组质粒并通过IPTG诱导表达融合蛋白,经HIS柱子亲和纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗loc558117多克隆抗体,Western blot检测其抗体效价为1：1000,斑马鱼组织特异性较好。Western blot结果表明,loc558117蛋白在斑马鱼胚胎发育的各时期均表达,在成年斑马鱼的血液,心脏、眼睛、卵、脑中均有表达,且在血液的表达较强烈。利用斑马鱼loc558117基因特异性的morpholino反义寡核酸敲低loc558117基因的表达,结果显示斑马鱼胚胎的血液颜色变淡,尾部弯曲,黑色素形成缓慢,围心腔增大,心脏不能正常环化等。同时制备了地高辛标记的血细胞标志基因GATA2、SMAD5和hbbe3的反义RNA探针,整体原位杂交结果表明,这些血细胞标志基因在突变体中的表达受到抑制。总之,上述结果表明,loc558117参与早期血细胞的发育。这也为进一步研究loc558117基因在血细胞发育过程中的作用机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 血液发育的概述
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 造血的个体发生
• 1.1.3 血细胞发生的阶段
• 1.1.4. 血细胞发育成熟的形态变化规律
• 1.1.5.血细胞生成的调节
• 1.2 斑马鱼造血作用概述
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 斑马鱼血细胞形态学和生理学
• 1.2.3 红细胞和红细胞生成
• 1.2.4 骨髓细胞和髓细胞生成
• 1.2.5 血小板和血栓生成及凝固
• 1.2.7 造血作用的转录调控
• 1.2.8 造血作用和细胞因子信号的体液调控
• 1.3 锌指蛋白基因家族
• 1.3.1 锌指基因家族概述
• 1.3.2 锌指蛋白基因的结构
• 1.3.3 锌指蛋白基因在血液发育过程中的功能
• 1.4 TRIM基因家族
• 1.4.1 TRIM家族概述
• 1.4.2 TRIM家族的结构特点
• 1.4.3 TRIM家族的进化
• 1.5 本文研究的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 酶类和试剂盒
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 缓冲液和培养基
• 2.1.4 其他试剂
• 2.1.5 主要实验仪器
• 2.1.6 生物信息学分析的主要软件与数据库
• 2.2 方法
• 2.2.1 常规PCR
• 2.2.2 引物设计与合成
• 2.2.3 总RNA的抽提
• 2.2.4 反转录RT-PCR
• 2.2.5 PCR产物的纯化回收
• 2.2.6 连接T载体
• 2.2.7 感受态细胞的制备
• 2.2.8 连接产物的转化（热休克法）
• 2.2.9 重组克隆的筛选和鉴定
• 2.2.10 质粒酶切
• 2.2.11 测序
• 2.2.12 重组质粒的构建
• 2.2.13 SDS-PAGE
• 2.2.14 Western blot免疫印迹分析
• 2.2.15 原核细胞的蛋白表达及纯化
• 2.2.16 多克隆抗体的制备
• 2.2.17 组织中总蛋白的提取
• 2.2.18 地高辛标记RNA探针的合成
• 2.2.19 斑马鱼整体胚胎原位杂交
• 2.2.20 斑马鱼morpholino
• 2.2.21 Wright-Giemsa染色法
• 3 实验结果及其分析
• 3.1 斑马鱼loc558117基因生物信息学分析
• 3.2 loc558117在原核细胞中的表达及多克隆抗体的制备
• 3.2.1 pMD18-T-loc558117质粒的构建
• 3.2.2 pET-28a-loc558117质粒的构建
• 3.2.3 loc558117基因在原核细胞中的蛋白诱导表达及纯化
• 3.2.4 斑马鱼loc558117多克隆抗体制备
• 3.2.5 Western blot分析loc558117在斑马鱼发育各组织的表达
• 3.3 原位杂交分析loc558117基因在斑马鱼中的表达
• 3.3.1 PGEMT-EASY-loc558117质粒的构建
• 3.3.2 原位杂交分析loc558117在斑马鱼发育中的表达
• 3.4 利用morpholino oligos敲减技术研究loc558117的功能
• 3.4.1 morpholino沉默引起斑马鱼胚胎形态变化
• 3.4.2 RT-PCR分析morpholino沉默对血液发育标志基因影响
• 3.4.3 原位杂交分析hbbe3基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达
• 3.4.4 原位杂交分析GATA2基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达
• 3.4.5 morpholino注射斑马鱼对loc558117及NKX2.5表达的影响
• 4 讨论
• 5 其他工作——LRRC39基因研究
• 5.1 LRRC39基因背景介绍
• 5.2 亚细胞定位
• 5.3 蛋白水平的组织表达情况
• 5.4 对肿瘤抑癌基因的影响
• 结语
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢