论文摘要
随着生活水平的提高、生活方式的改变和人口老龄化，糖尿病（diabetes mellitus，DM）的患病率在全球迅速增加，已经成为发达国家中继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，是严重危害人类健康的世界性公共卫生问题。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要并发症之一，总发生率为47.66％，是1型DM患者的主要死亡原因，在2型DM，其严重性仅次于冠状动脉和脑动脉粥样硬化病变。在西方国家，17％-33.8％接受肾脏替代治疗的肾衰竭病人是由于DN引起的，DN已经成为慢性肾衰竭的首要病因。而且在接受肾脏替代治疗过程中，DM患者的死亡率远远高于非DM患者，其2年生存率仅50％左右。因此，如何有效地预防、治疗DN已成为医学界共同关注的问题。DN的发病机制十分复杂，迄今尚不清楚。目前认为氧化应激（oxidative stress，OS）是重要的共同机制，在DM的慢性并发症中可能起主要作用。同时，近年来人们认识到DM时存在。肾脏局部肾素．血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的异常，可能与DN的发生发展关系密切，血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）是RAS中的主要活性中心，通过与其特异性1型受体AT1R结合而发挥一系列致病作用，可导致肾小球硬化及肾间质纤维化。大量研究证实，应用血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibition，ACEI）或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensinⅡreceptor antagonist，ARB）阻断RAS均可抑制肾脏肥大，降低尿白蛋白排泄，延缓DN的进展。另外，晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）也是DN发病机制中的重要因素之一，主要通过与其受体（receptor for advanced glycation end products，RAGEs）结合引发生物学效应，在DN的发生、发展过程中与RAGEs相互作用组成调控网络，因而AGEs-RAGEs系统对于研究DN的发病机制具有重要的意义。目前DN的西医治疗措施除饮食治疗、控制血糖等之外，以ACEI、ARB的应用最为广泛和重要，但这些方法临床疗效均相当有限，迄今尚无针对DN的特效西药。DN属于中医的“肾消”、“水肿”、“肾劳”、“关格”等范畴，脾肾虚是DN的发病基础，痰湿、浊毒、瘀血等是其发展过程中的促进因素，本虚标实是DN的病机特点。DN早期（Ⅰ～Ⅲ期）多表现阴虚或气阴两虚；DN临床期（Ⅳ期）多表现脾肾亏虚、水湿内停或夹瘀血阻络；DN终末期（Ⅴ期）多表现脾肾阴阳衰败、浊毒中阻。因此，对Ⅲ～Ⅳ期DN的治疗上以益气健脾、滋肾养阴兼活血通络为法。虽然中医药在DN的治疗方面具有比较明显的优势，但绝大多数尚处于疗效观察和经验积累阶段，目前国内外未见对DN具有确切疗效的中药新药问世。我们在对DN的长期临床治疗和研究过程中，精心筛选提炼药物组方，命名为肾康丸，经反复临床验证，疗效十分确切，并已申请国家发明专利（肾康丸的组方及工艺研究，专利号200610036515．2）。肾康丸由黄芪、金樱子、益母草等药物组成，功能益气健脾、补肾固涩、利尿消肿、活血通络，暗合Ⅲ～Ⅳ期DN的病因病机，具有标本兼治之功。但其治疗DN的细胞分子水平的作用机制还不清楚，有待进一步研究。本研究通过DN大鼠模型从多个方面探讨了肾康丸治疗DN的细胞分子基因水平的作用机制，为其临床应用提供实验依据。具体如下：第一部分肾康丸对DN大鼠的肾脏保护作用目的：观察肾康丸对DN大鼠模型的治疗及肾脏保护作用，为进一步研究其作用机制提供实验依据。方法：首先用链脲佐菌素（STZ）按55 mg╱kg大鼠体重一次性腹腔内注射法建立大鼠DM模型，连续2周测血糖、尿糖、尿量，以连续三次空腹血糖＞16.6mmol／L、尿糖强阳性、尿量＞原尿量150％、尿微量白蛋白定性测量阳性者为DN成模标准。造模过程中大鼠死亡率为17.65％。4周后将模型大鼠随机分为4组（n=7）：肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组、DN模型组。所有大鼠均在同一动物房内用代谢笼分笼饲养，标准饮食，自由进水。另设正常对照组（n=6）。灌胃给药治疗8周，观察大鼠一般状况、血糖、尿糖。末次给药后将大鼠放入代谢笼中，计24 h尿量和饮水量。然后用10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主动脉穿刺采血，分离血清，检测大鼠血糖（Glu）、24 h尿蛋白定量、血肌酐（Cr）、尿素氮（UN）、血总胆固醇（TC）、血甘油三酯（TG）；取大鼠肾脏，观察肾脏大小，计算肾重、相对肾重，并通过HE染色法和电镜观察大鼠肾脏组织病理变化。统计学方法：数据以均数±标准差（（?）±s）表示。应用SPSS13.0统计软件，治疗前后两组间比较采用配对t检验、多组间比较采用重复测量方差分析，治疗后多组间比较采用One Way ANOVE、SNK检验；方差不齐者首先进行数据变换，若数据变换后仍不齐者多组间多重比较采用多个独立样本非参数分析Kruskal-Wallis检验，检验水平a=0.05。结果：1．34只大鼠用于造模，成模率82.35％（28／34），成模后病死率14.29％（4／28）。2．在8周治疗期间内，DN模型组大鼠血糖均维持在16.6 mmol／L以上，尿糖（+++）以上；表现出多饮、多食、多尿、消瘦的DM症状。3．与正常组大鼠比较，DN模型组大鼠UN、cr、TC、TG、24 h尿蛋白定量等指标均升高，具有显著性意义（P＜0.01）；肾脏重量及相对肾重增加，具有显著性意义（P＜0.01），且出现了相当于Mogensen分期3期DN的肾脏病理损害。4．与DN模型组大鼠比较，除厄贝沙坦组大鼠Glu、TC、TG无显著性意义（P＞0.05）外，三个治疗组均可见大鼠一般状况改善，上述指标水平降低，具有显著性意义（P＜0.01），同时可见肾脏组织病理损害减轻。5．肾康丸与厄贝沙坦对DN大鼠具有协同肾脏保护作用。结论：1．肾康丸对DN大鼠具有肾脏保护作用。2．肾康丸与厄贝沙坦对DN大鼠肾脏具有协同保护作用。第二部分肾康丸对DN大鼠肾脏氧化应激的影响目的：探讨肾康丸对DN大鼠肾脏氧化应激的影响。方法：取第一部分各组大鼠肾脏，检测肾组织丙二醛（MDA）含量以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、铜锌超氧化物歧化酶（Cu，Zn-SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性；采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法观察各组大鼠肾组织GSH-Px、Cu，Zn-SOD、CAT mRNA表达情况。统计学方法：数据以均数±标准差（（?）±s）表示。应用SPSS13.0统计软件，治疗后多组间比较采用One Way ANOVE、SNK检验；方差不齐者首先进行数据变换，若数据变换后仍不齐者多组间多重比较采用多个独立样本非参数分析Kruskal-Wallis检验，检验水平a=0.05。结果：1．DN模型组大鼠与正常组大鼠比较，肾组织中MDA含量升亩，抗氧化酶GSH-Px、Cu，Zn-SOD、CAT活性下降，GSH-Px、Cu，Zn-SOD mRNA表达水平增高，均具有统计学意义（P＜0.01）；但肾组织中CAT mRNA表达水平无显著性差异（P＞0.05）。2．治疗后五组肾组织MDA含量存在显著性差异（穿=26．753，JF，<0．001），DN模型组秩次最高；三个治疗组比较，厄贝沙坦组秩次最高。3．治疗后五组间肾组织CAT、GSH-Px与Cu,Zn-SOD存在显著性差异（F值分别为100.231、91.88、133.868，P=0.000），肾康丸组、厄贝沙坦组、两药合用组与DN模型组比较CAT、GSH-Px与Cu，Zn-SOD活性明显升高（P＜0.001）。三个治、疗组比较，肾康丸组、厄贝沙坦组之间无显著性差异（P分别为0.097，0.452，0.086），但均与两药合用组存在显著性差异（P＜0.001）。4．治疗后五组间肾组织CAT mRNA表达水平无显著性差异（P=0.216），GSH-Px、Cu，Zn-SOD mRNA表达水平存在显著性差异（X2=23.287、F=29.099，P＜0.001）。五组间比较，DN模型组GSH-Px mRNA相对表达量秩次最高；三个治疗组比较，肾康丸组GSH-Px mRNA相对表达量秩次最高。三个治疗组Cu，Zn-SOD mRNA相对表达量与DN模型组比较均显著升高（P＜0.001），其中两药合用组与肾康丸组、厄贝沙坦组比较存在显著性差异（P＜0.01），但肾康丸组、厄贝沙坦组之间比较均无统计学差异（P=0.350）结论：1．肾康丸可以抑制DN大鼠肾脏的氧化应激。2．肾康丸与厄贝沙坦对DN大鼠肾脏的氧化应激具有协同抑制作用。第三部分肾康丸对DN大鼠肾脏AngⅡ及其受体AT1R表达的影响目的：探讨肾康丸对DN大鼠AngⅡ及其1型受体AT1R表达的影响。方法：取第一部分各组大鼠血浆、肾脏，采用放射免疫法检测血浆和肾组织AngⅡ含量，免疫组化法检测肾组织AngⅡ、AngⅡ1型受体AT1R的表达，RT-PCR法检测肾组织AT1R mRNA的表达。统计学方法：数据以均数±标准差（（?）±s）表示。应用SPSS13.0统计软件，治疗后多组间比较采用One Way ANOVE、SNK检验；方差不齐者首先进行数据变换，若数据变换后仍不齐者多组间多重比较采用多个独立样本非参数分析Kruskal-Wallis检验，检验水平a=0.05。结果：1．DN模型组大鼠与正常对照组比较，血浆及肾组织AngⅡ含量均明显升高（P＜0.001）。治疗后五组间血浆及肾组织AngⅡ均存在显著差异（F值分别为50.152、126.110，P=0.000）。与DN模型组比较，肾康丸组血浆及肾组织AngⅡ含量明显降低（P＜0.001），厄贝沙坦组、两药合用组血浆及肾组织AngⅡ含量均较肾康丸组明显升高（P＜0.001）。2．治疗后五组间肾组织AngⅡ免疫组化相对表达量也存在显著性差异（X2=23.837，P=0.000），厄贝沙坦组肾组织AngⅡ免疫组化相对表达量秩次最高。3．治疗后五组间肾组织AT1R含量及其mRNA相对表达量均存在显著性差异（X2分别为24.366、22.748，P=0.000），DN模型组肾组织AT1R含量及其mRNA相对表达量秩次均最高。三个治疗组比较，两药合用组肾组织AT1R含量及其mRNA相对表达量秩次最低，厄贝沙坦组次之。结论：1．肾康丸可以降低DN大鼠血浆、肾组织AngⅡ水平以及肾组织AT1R含量，抑制肾组织AT1R mRNA表达。2．肾康丸可以部分拮抗厄贝沙坦引起的DN大鼠血浆及肾组织AngⅡ水平增高。第四部分肾康丸对DN大鼠肾脏AGEs及其受体RAGEs表达的影响目的：探讨肾康丸对DN大鼠AGEs及其受体RAGEs表达的影响。方法：取第一部分各组大鼠血清、肾脏，检测血清和肾组织AGEs含量，免疫组化法检测肾组织RAGEs的表达，RT-PCR法检测肾组织RAGEs mRNA的表达。统计学方法：数据以均数±标准差（（?）±s）表示。应用SPSS13.0统计软件，治疗后多组间比较采用One Way ANOVE、SNK检验；方差不齐者首先进行数据变换，若数据变换后仍不齐者多组间多重比较采用多个独立样本非参数分析Kruskal-Wallis检验，检验水平a=0.05。结果：1．DN模型组大鼠与正常对照组比较，血清及肾组织AGEs含量均明显升高（P＜0.01）。与DN模型组比较，三个治疗组血清及肾组织AGEs含量均明显降低（P＜0.01）；与肾康丸组、厄贝沙坦组比较，两药合用组血清（P＜0.05）及肾组织（P＜0.01）AGEs含量均明显降低；肾康丸组、厄贝沙坦组之间比较均无显著性差异（P＞0.05）。2．DN模型组大鼠与正常对照组比较，肾组织RAGEs含量及其mRNA表达水平均明显升高（P＜0.01）。与DN模型组比较，三个治疗组肾组织RAGEs含量及其mRNA表达水平均明显降低（肾康丸组、厄贝沙坦组P＜0.05，两药合用组P＜0.01）；与肾康丸组、厄贝沙坦组比较，两药合用组肾组织RAGEs含量及其mRNA表达水平均明显降低（P＜0.05）；肾康丸组、厄贝沙坦组之间比较均无显著性差异（P＞0.05）。结论：1．肾康丸可以降低DN大鼠血清、肾组织AGEs水平以及肾组织RAGEs含量，抑制肾组织RAGEs mRNA表达。2．肾康丸与厄贝沙坦对DN大鼠AGEs-RAGEs系统具有协同抑制作用。全文结论：本研究通过DN动物模型实验研究，再次证明肾康丸具有治疗DN和保护肾脏的作用，其作用机理与抑制氧化应激，减少AngⅡ的生成及其受体AT1R的表达，降低AGEs的含量及其受体RAGEs的表达有关，为其临床推广应用于治疗DN提供了较为全面、深入的分子水平的理论依据。
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标签：糖尿病肾病论文; 肾康丸论文; 氧化应激论文; 血管紧张素论文; 晚期糖基化终产物论文;