口服微囊化卵黄免疫球蛋白（IgY）的制备及性能研究

论文摘要

口服特异性卵黄免疫球蛋白（Egg yolk immunoglobulin,IgY）可治疗由细菌或病毒引起的肠道疾病,具有安全无残留、不产生抗药性、服用简便等优点,是一种具有广阔应用前景的抗生素替代品。但IgY在高强度的胃酸环境中易被胃蛋白酶降解,失去抗体活性。因此,如何避免IgY在胃中失活,而在小肠中稳定地发挥作用,是一个亟待解决的问题。针对这一问题,本论文采用微囊化技术包埋IgY,制备口服型IgY-壳聚糖-海藻酸钠微囊,从体外、体内两方面评价壳聚糖-海藻酸钠微囊作为IgY口服载体的可行性。本研究以引起仔猪腹泻的最主要致病菌——产肠毒素大肠杆菌K88为抗原,免疫蛋鸡后获得特异性IgY。通过对获得高效价特异性IgY的最佳抗原浓度研究发现,K88菌毛蛋白对蛋鸡的免疫原性优于全菌;纯化的菌毛蛋白对蛋鸡的免疫原性优于粗菌毛蛋白,其诱导的抗体效价最高可达1:480000;确定菌毛蛋白的最佳浓度为2 mg/ml,全菌的最佳浓度为1010cfu/ml。通过对IgY的分离纯化条件研究发现,盐析法提取IgY的最佳条件是将粗提的IgY经50%饱和度的硫酸铵盐析一次,再经14%（w/v）硫酸钠盐析一次,获得的IgY回收率可达46%,纯度可达77%;经超滤（100 kDa）后,最终获得的IgY冻干粉纯度为82%。对IgY稳定性的研究结果表明,温度不超过70℃时,IgY具有良好的热稳定性;pH＜3时,IgY活性大部分丧失;IgY对胰蛋白酶有较好的抵抗力,但低pH条件下对胃蛋白酶十分敏感;冷冻干燥处理对IgY活性有不利的影响;-20℃和4℃环境中,IgY冻干粉具有良好的贮藏稳定性。为保护IgY的口服活性,选用天然材料海藻酸钠和壳聚糖作为壁材,利用气体吹喷制囊法,制备IgY-壳聚糖-海藻酸钠微囊。考察了成囊装置主要的物理条件对空白壳聚糖-海藻酸钠微囊粒径及形态的影响,确定制备微囊的最佳物理条件为:空气压力0.3m3/h,,液面距8 cm,恒流泵速度4 ml/min,搅拌子转速200 r/min。此条件下制备的新鲜微囊球形圆整,平均粒径约1 mm,且粒径分布集中。在此基础上,探讨了主要反应条件对微囊的载药量、包封率、保护IgY在模拟胃液中的稳定性、以及微囊在体外的释放行为的影响。确定制备微囊的优化条件为:成囊溶液pH 3.5,壳聚糖浓度0.2%（w/v）,CaCl2浓度0.5%（w/v）,海藻酸钠浓度2%（w/v）,药载比25%,在此优化条件下制备的IgY微囊载药量高于20%,包封率高于75%,IgY在模拟胃液中2 h累积释放率小于10%,而在模拟肠液中4 h累积释放率大于80%。另外,ELISA和SDS-PAGE结果显示,IgY微囊在模拟胃液中可抵抗胃蛋白酶的降解,而且抗体的活性保持在70%以上。将IgY-壳聚糖-海藻酸钠微囊用于断奶仔猪的攻毒治疗试验,结果表明,腹泻断奶仔猪服用IgY微囊后,病情很快得到控制,1 d后所有病猪得到治愈,而且体重增加最快;而未包埋的IgY冻干粉治疗效果低于微囊化IgY,3 d后所有病猪得到治愈。而对照组仔猪口服生理盐水,第1 d有腹泻症状的仔猪3 d后仍未见好转,体重下降。由此可见,IgY经壳聚糖-海藻酸钠微囊包埋后,可以很好的保护其在胃酸环境中的抗体活性,并且可于小肠中定点释放,能有效治愈断奶仔猪腹泻。综上,本研究制备的IgY微囊,可保证IgY以较高的活性到达小肠,并在肠道中定点释放,稳定的发挥作用。其作为一种新型的口服动物保健产品,将具有良好的产业化前景。本研究也为其他口服生物活性物质的控释制剂开发奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 IgY的研究进展
• 1.1.1 IgY的结构及功能
• 1.1.2 IgY的性质
• 1.1.3 IgY分离纯化方法的研究进展
• 1.1.4 IgY应用的研究进展
• 1.1.5 保护IgY口服活性的研究进展
• 1.2 壳聚糖-海藻酸钠生物微囊的研究进展
• 1.2.1 微囊化技术概况
• 1.2.2 壳聚糖与海藻酸钠
• 1.2.3 壳聚糖和海藻酸钠反应微囊化原理
• 1.2.4 壳聚糖-海藻酸钠微囊的制备方法
• 1.2.5 壳聚糖-海藻酸钠生物微囊的应用研究进展
• 1.3 本论文的研究意义和主要工作
• 参考文献
• 2 抗产肠毒素大肠杆菌K88的特异性IgY的制备
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料及设备
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 菌种
• 2.2.3 试剂
• 2.2.4 仪器
• 2.2.5 溶液配置
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细菌培养及菌毛的制备、纯化
• 2.3.2 免疫原的制备
• 2.3.3 蛋鸡的免疫
• 2.3.4 鸡蛋的收集及水溶性组分的提取
• 2.3.5 间接ELISA法检测特异性 IgY抗体效价的建立
• 2.3.6 蛋白质含量的测定
• 2.3.7 菌毛蛋白纯度的测定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 菌毛的纯化
• 2.4.2 棋盘滴定法确定抗原包被量
• 2.4.3 不同浓度的菌毛蛋白对蛋鸡的免疫效果
• 2.4.4 不同浓度的全菌对蛋鸡的免疫效果
• 2.4.5 菌毛蛋白与全菌对蛋鸡免疫效果的比较
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 参考文献
• 3 IgY的分离、纯化及稳定性研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料及设备
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 仪器
• 3.2.4 溶液配置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 IgY分离、纯化的工艺路线
• 3.3.2 IgY含量测定
• 3.3.3 IgY回收率及纯度测定
• 3.3.4 IgY活性检测
• 3.3.5 热处理
• 3.3.6 不同酸度处理
• 3.3.7 胃蛋白酶处理
• 3.3.8 胰蛋白酶处理
• 3.3.9 IgY的冷冻干燥稳定性
• 3.3.10 IgY的贮藏稳定性
• 3.4 结果与分析
• 4）₂SO₄盐析条件的优化'>3.4.1 （NH₄）₂SO₄盐析条件的优化
• 2SO₄盐析条件的优化'>3.4.2 Na₂SO₄盐析条件的优化
• 3.4.3 IgY的分离及纯化
• 3.4.5 IgY的热稳定性
• 3.4.6 IgY的酸稳定性
• 3.4.7 IgY对胃蛋白酶的稳定性
• 3.4.8 IgY对胰蛋白酶的稳定性
• 3.4.9 IgY的冷冻干燥稳定性
• 3.4.10 IgY的贮藏稳定性
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 参考文献
• 4 IgY微囊的制备及性能表征
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料及设备
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 仪器
• 4.2.4 溶液配置
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 空白壳聚糖-海藻酸钠微囊的制备、粒径分布及形态学研究
• 4.3.2 IgY微囊的制备、粒径分布及形态学研究
• 4.3.3 IgY微囊性能检测
• 4.3.4 数据处理
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 物理条件对空白微囊粒径及形态学的影响
• 4.4.2 成囊溶液的pH对微囊性能的影响
• 4.4.3 壳聚糖浓度对微囊性能的影响
• 2浓度对微囊性能的影响'>4.4.4 CaCl₂浓度对微囊性能的影响
• 4.4.5 海藻酸钠浓度对微囊性能的影响
• 4.4.6 药载比对微囊性能的影响
• 4.4.7 微囊体外释放形貌观察
• 4.5 讨论
• 4.5.1 成囊溶液的pH对微囊性能的影响
• 4.5.2 壳聚糖浓度对微囊性能的影响
• 2浓度对微囊性能的影响'>4.5.3 CaCl₂浓度对微囊性能的影响
• 4.5.4 海藻酸钠浓度对微囊性能的影响
• 4.5.5 药载比对微囊性能的影响
• 4.6 小结
• 参考文献
• 5 IgY微囊对攻毒仔猪的治疗试验
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料及设备
• 5.2.1 试验动物
• 5.2.2 菌种
• 5.2.3 实验材料
• 5.2.4 试剂
• 5.2.5 仪器
• 5.2.6 溶液配置
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 细菌培养
• 5.3.2 IgY微囊的制备
• 5.3.3 仔猪攻毒及治疗试验
• 5.3.4 效果判定
• 5.3.5 ETEC K88浓度检测
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 临床观察
• 5.4.2 直肠拭子中ETEC K88浓度变化
• 5.4.3 胃及小肠pH值
• 5.5 讨论
• 5.6 小结
• 参考文献
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 创新点摘要
• 附录A 成囊系统装置图
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢