云南杂草双生病毒的分子鉴定

论文题目: 云南杂草双生病毒的分子鉴定

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 江彤

导师: 周雪平

关键词: 杂草,变异,重组,复合侵染

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 双生病毒在云南烟草、番茄和南瓜等多种作物上广泛发生,并已造成严重危害。由于双生病毒可能在杂草和农作物之间相互传染,为此我们对云南杂草上的的双生病毒开展了研究。从云南赛葵、胜红蓟和稀硷上采集了39个双生病毒样品,部分序列测定表明,它们由不同病毒侵染。 Y160分离自赛葵,全序列测定表明,它与赛葵黄脉病毒(MYVV)的同源性最高,为82.2%。因此它是双生病毒新种,命名为云南赛葵黄脉病毒(Malvastrum yellow vein Yunnan virus,MYVYNV)。MYVYNV伴随有卫星DNA分子,它与MYVV DNAβ的序列同源性最高,为72.3%。序列比较发现MYVYNV可能是由MYVV和泰国番茄黄化曲叶病毒(TYLCTHV)重组形成的。构建了Y160 DNA-A和DNAβ的侵染性克隆。DNA-A单独接种以及DNA-A和DNAβ混合接种均可系统侵染本氏烟,DNAβ对于Y160 DNA-A的侵染不是必需的。DNAβ虽然不是症状的诱导因子,但伴随其辅助病毒DNA-A共同侵染时能加重病害症状,而且DNAβ可以显著增强DNA-A在植物中的积累。从云南不同地区表现黄脉症状的赛葵上分离了20个DNAβ,序列比较发现,20个DNAβ分子均与MYVV DNAβ的序列同源性最高,达93.2-97.3%,说明这20个DNAβ均属于伴随MYVV的卫星DNA分子。20个DNAβ分子相互间的序列同源性高达93.0-99.8%,说明从云南不同地区赛葵上分离的20个MYVV DNAβ分子的序列变异相对较小。DNAβ的变异可能与病毒的寄主范围有关联,病毒的寄主范围越窄,伴随DNAβ的变异越小。利用特异引物对采自云南各地的25个赛葵样品进行复合侵染检测。结果发现,25个样品中有13个能检测到MYVV和TYLCCNV的复合侵染,复合侵染率高达52%,说明田间自然发生的双生病毒复合侵染现象非常普遍。测定了赛葵病毒样品Y193、Y194全基因组DNA-A。序列比较表明,Y193和Y194相互间的序列同源性高达98.7%,它们与TYLCCNV-To[Y25]的同源性最高,分别为88.0%和87.7%,进一步比较发现,Y193和Y194分离物可能是由TYLCCNV和另一病毒重组形成的。

论文目录:

致谢

摘要

Abstract

第一章文献综述

1 双生病毒的发生与危害

2 双生病毒的分类与基因组结构

2．1 玉米线条病毒属(Mastrevirus)

2．2 甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)

2．3 番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)

2．4 菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)

3 双生病毒的侵染

3．1 双生病毒的复制

3．1．1 双生病毒复制所需的细胞环境——寄主细胞周期的激活

3．1．2 双生病毒复制相关的结构域

3．1．3 双生病毒的滚环复制

3．2 双生病毒的转录

3．3 双生病毒的移动

3．3．1 双组份双生病毒的移动

3．3．2 单组份双生病毒的移动

3．4 双生病毒的介体传毒

4 双生病毒的致病因子

5 双生病毒基因组的变异

5．1 突变

5．2 缺失和获取外源DNA

5．3 假重组

5．4 重组

5．4．1 属间重组

5．4．2 属内重组

6 双生病毒伴随的小分子DNA

6．1 DNA1分子

6．2 DNAβ分子

6．3 双生病毒与小分子DNA形成病害复合体

7 杂草上双生病毒研究进展

7．1 杂草上双生病毒的研究意义

7．2 杂草上双生病毒的发生状况

7．3 杂草上双生病毒的检测方法

8 立题意义

第二章材料与方法

1 材料

1．1 病毒

1．2 植物材料

1．3 菌株和质粒

1．4 试剂与仪器

1．5 常用缓冲液的配制

2 方法

2．1 植物总DNA提取

2．2 PCR技术

2．2．1 反应体系

2．2．2 反应参数

2．3 PCR产物纯化

2．4 DNA克隆技术

2．4．1 载体的去磷酸化

2．4．2 连接

2．4．3 感受态细胞制备方法

2．4．4 转化

2．5 重组质粒的提取与鉴定

2．5．1 碱裂解法

2．5．2 质粒微量提取试剂盒

2．5．3 PCR鉴定

2．5．4 酶切鉴定

2．6 Southern blot分析

2．6．1 转膜

2．6．2 探针标记

2．6．3 杂交和洗膜

2．6．4 免疫显色

2．7 侵染性克隆的转化

2．7．1 三亲交配法

2．7．2 电击法

2．8 农杆菌接种

第三章云南杂草上双生病毒的PCR快速检测

1 材料与方法

1．1 病毒

1．2 植物总DNA提取

1．3 PCR扩增、克隆及序列测定

1．4 序列分析

2 结果与分析

3 讨论

第四章侵染赛葵的双生病毒的分子鉴定

第一节云南赛葵黄脉病毒及其卫星DNA的基因组结构

1 材料与方法

1．1 病毒

1．2 植物总 DNA提取

1．3 PCR扩增、克隆和测序

1．4 序列分析

2 结果与分析

2．1 病毒基因组 DNA-A结构

2．2 Y160 DNA-A与其它双生病毒的比较及分子进化分析

2．3 病毒基因组 DNAβ结构

2．4 Y160 DNAβ与其它双生病毒DNAβ的比较及其分子进化分析

3 讨论

第二节云南赛葵黄脉病毒及其卫星DNA的致病性研究

1 材料与方法

1．1 MYVYNV-Y160 DNA-A侵染性克隆的构建

1．2 MYVYNV-Y160 DNAβ侵染性克隆的构建

1．3 MYVYNV-Y160 DNA-A和DNAβ在同一植物表达载体上的构建

1．4 侵染性克隆的转化

1．5 农杆菌接种

1．6 病毒DNA的PCR鉴定

1．7 病毒DNA的Southern印迹检测

2 结果与分析

2．1 MYVYNV-Y160 DNA-A和DNAβ的致病性测定

2．2 MYVYNV-Y160寄主范围的测定

2．3 病毒DNA的Southern印迹检测分析

3 讨论

第三节赛葵黄脉病毒卫星DNA的基因组结构及变异

1 材料与方法

1．1 病毒

1．2 植物总DNA提取

1．3 PCR扩增、克隆和测序

1．4 序列分析

2 结果与分析

2．1 DNAβ分子的结构特征及变异

2．2 DNAβ核苷酸序列及分子进化分析

3 讨论

第四节赛葵上双生病毒复合侵染的测定

1 赛葵是中国番茄黄化曲叶病毒的寄主

1．1 材料与方法

1．1．1 病毒

1．1．2 植物总 DNA提取

1．1．3 PCR扩增、克隆和测序

1．2 结果与分析

1．2．1 DNA-A复合侵染检测

1．2．2 DNAβ复合侵染检测

1．3 讨论

2 侵染赛葵的中国番茄黄化曲叶病毒的基因组结构

2．1 材料与方法

2．1．1 病毒

2．1．2 植物总 DNA提取

2．1．3 PCR扩增、克隆和测序

2．1．4 序列分析

2．2 结果与讨论

2．2．1 病毒基因组DNA-A结构

2．2．2 Y193、Y194 DNA-A与其它双生病毒的比较及分子进化分析

2．2．3 Y193、Y194是重组形成的TYLCCNV分离物

第五章侵染胜红蓟的双生病毒的分子鉴定

1 材料与方法

1．1 病毒

1．2 植物总DNA提取

1．3 PCR扩增、克隆和测序

1．4 序列分析

2 结果与分析

2．1 Y206 DNA-A和DNAβ基因组结构及分子进化分析4

2．2 Y282 DNA-A基因组结构及分子进化分析

2．3 Y283 DNA-A基因组结构及分子进化分析

3 讨论

第六章稀硷上与中国番茄黄化曲叶病毒伴随的卫星 DNA的基因组结构

1 材料与方法

1．1 病毒

1．2 植物总 DNA提取

1．3 PCR扩增、克隆和测序

1．4 序列分析

2 结果与讨论

2．1 病毒基因组 DNAβ结构

2．2 从稀硷中分离的6个 DNAβ与其它双生病毒DNAβ的比较

2．3 与TYLCCNV伴随的DNAβ分子的进化分析

全文小结

参考文献

附录A: 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器

附录B: 常用缓冲液及培养基配方

附录C: EMBL登陆基因

附录D: 博士研究生期间发表及投稿中的学术论文

发布时间: 2005-07-22

参考文献

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[5].海南杂草双生病毒的分子鉴定及病毒致病性研究[D]. 熊庆.浙江大学2005
[6].双生病毒卫星DNA的βC1基因缺失突变体的致病性及稳定性测定和缺失突变体的利用[D]. 钱亚娟.浙江大学2005
[7].四种双生病毒的分子鉴定[D]. 郭小建.浙江大学2006
[8].广西双生病毒的分子鉴定[D]. 徐幼平.浙江大学2006
[9].三种双生病毒及其伴随卫星DNA的致病性研究[D]. 郭维.浙江大学2008
[10].我国五种双生病毒的分子鉴定及致病性研究[D]. 吴剑丙.浙江大学2008

云南杂草双生病毒的分子鉴定

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