小桐子组织培养体系的建立及遗传转化的初步研究

论文摘要

小桐子是大戟科（Euphorbiaceae）麻风树属（Jatropha）的多年生小乔木或灌木,其种子含油量可达40%,是一种极具发展潜力的生物柴油原料植物。本研究以小桐子子叶为外植体,建立了高效的新的子叶再生体系。在含有BAP（N6-benzyladenine,N6-苄基腺嘌呤）和CaCl2的培养基中,其愈伤组织诱导率可达100%,平均每个外植体芽的数量最多可达15个,最佳的诱导愈伤组织和芽培养基成分为MS + BAP （2.0 mg/l） + CaCl2 （6 mM）,芽再生率为93.47%。最佳生根培养基为1/2 MS + sucrose （2%） + NAA （0.12 mg/l） + IBA （0.12 mg/l） + Gelzan （1.5 g/l）,生根率可达90%且切口处无愈伤组织。利用此种方法在以叶片（可产生6-8个芽）、叶柄（可产生6-8个芽）、叶脉（可产生2-3个芽）及多花品种叶片（可产生2-3个芽）为外植体进行再生种也有较好的效果。此外,将诱导的愈伤组织直接放入含GA3（Gibberellic acid,赤霉素）的培养基（MS + BAP （2.0 mg/l）+ GA3 （0.01 mg/l））后,能够很快诱导芽的生长,而且平均每个外植体芽的数量也增加至21个左右。取一个月幼苗的茎、子叶、真叶叶片、真叶叶柄4种外植体分别在CD（MS + 2.0 mg/l 2,4-D）和CDK（MS + 2.0 mg/l 2,4-D + 0.1 mg/l KN）培养基诱导愈伤组织,近一年后,取0.1g愈伤组织在液体培养基S1（MS + 2.0 mg/l 2,4-D）中进行悬浮培养,其中子叶在培养基CDK诱导的愈伤组织悬浮细胞最佳。以此为材料,分别对悬浮细胞的基本培养基、最低起始接种量、蔗糖浓度、pH值、激素浓度等进行了优化,其中悬浮细胞最低起始接种量为10 mg/ml,最佳液体培养基为B5 salts + B5 viatamins + 2,4-D （2.0 mg/l） + KN （0.2 mg/l） + sucrose （30 g/l）, pH = 4.8-5.8。农杆菌介导转化子叶实验中,报告基因（gus基因）最佳条件为采用农杆菌EHA105,共培养培养基的pH为5.4,共培养6天,其瞬时表达率可达92.36%。基因枪转化小桐子子叶的最佳条件是氦气压力为1350 psi,靶距离为9 cm,其报告基因（gus基因）瞬时表达率可达46%。小桐子再生体系的建立为今后小桐子优良品种的快繁提供了保障,悬浮细胞的建立为今后通过悬浮细胞再生、原生质体的分离等奠定了基础,农杆菌介导和基因枪转化瞬时表达条件的优化为获得稳定的小桐子转化体系提供了参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 小桐子简介及研究概况
• 1.2 植物组织培养
• 1.3 小桐子组织培养
• 1.3.1 小桐子不定芽发生途径
• 1.3.2 小桐子体细胞胚发生途径
• 1.3.3 小桐子悬浮细胞的培养
• 1.3.4 小桐子节间的培养
• 1.4 植物遗传转化
• 1.4.1 农杆菌介导转化法
• 1.4.2 基因枪轰击转化法
• 1.4.3 瞬时表达对稳定转化的作用
• 1.5 小桐子遗传转化研究
• 1.5.1 农杆菌介导转化小桐子
• 1.5.2 基因枪轰击转化小桐子
• 1.6 本论文研究的目的和意义
• 第2章 小桐子组织培养体系的建立
• 2.1 植物材料
• 2.2 试剂和仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 试剂的配制
• 2.3.2 培养条件
• 2.3.3 外植体的处理和消毒
• 2.3.4 组织培养方法及实验设计
• 2.3.5 移栽组织培养幼苗
• 2.3.6 数据处理及分析
• 2.4 结果与分析
• 2 诱导芽的过程'>2.4.1 BAP 和CaCl₂诱导芽的过程
• 2 对愈伤组织诱导的影响'>2.4.2 BAP 和CaCl₂对愈伤组织诱导的影响
• 2 对诱导体细胞胚和芽的影响'>2.4.3 BAP 和CaCl₂对诱导体细胞胚和芽的影响
• 2.4.4 以上方法在其他外植体的应用
• 2.4.5 BAP 和GA3诱导芽的过程
• 2.4.6 GA3 对诱导芽的影响
• 2.5 讨论与展望
• 2和BAP 在小桐子组织培养中作用'>2.5.1 CaCl₂和BAP 在小桐子组织培养中作用
• 2.5.2 小桐子组培幼苗生根
• 2.5.3 GA3 在小桐子组织培养中作用
• 第3章 小桐子悬浮细胞的培养
• 3.1 植物材料
• 3.2 试剂和仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 试剂的配制
• 3.3.2 悬浮细胞培养的方法
• 3.3.3 生长曲线测定及细胞计数
• 3.3.4 培养条件
• 3.3.5 数据处理与分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 愈伤组织的诱导及悬浮培养选择最佳愈伤组织
• 3.4.2 振荡频率对悬浮细胞的影响
• 3.4.3 基本培养基（B5 和MS）对悬浮细胞的影响
• 3.4.4 最低起始接种量的确定
• 3.4.5 2,4-D 浓度对悬浮细胞的影响
• 3.4.6 蔗糖浓度和pH 值对悬浮细胞的影响
• 3.4.7 2,4-D 与其他激素组合对悬浮细胞的影响
• 3.4.8 KN 浓度对悬浮细胞的影响
• 3.4.9 小桐子悬浮细胞与其他物种悬浮细胞的比较
• 3.5 讨论与展望
• 第4章 小桐子遗传转化的初步研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 质粒和菌株
• 4.1.3 PCR 引物
• 4.1.4 基因枪耗材
• 4.2 试剂和仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 试剂的配制
• 4.3.2 大肠杆菌感受态制备及转化
• 4.3.3 农杆菌电击转化
• 4.3.4 CTAB 法提取植物基因组DNA
• 4.3.5 质粒的小量提取（酚抽提法）
• 4.3.6 质粒的大量提取（用于基因枪）
• 4.3.7 农杆菌介导转化子叶和下胚轴
• 4.3.8 基因枪的操作
• 4.3.9 GUS 组织化学染色
• 4.3.10 数据处理与分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 农杆菌介导转化小桐子子叶和下胚轴的初步研究
• 4.4.2 基因枪轰击转化小桐子子叶的初步研究
• 4.5 讨论与展望
• 4.5.1 农杆菌介导转化小桐子
• 4.5.2 基因枪轰击转化小桐子
• 4.5.3 不能获得转基因植株原因分析
• 参考文献
• 附录
• 致谢