乳酸乳球菌中冷应激蛋白的表达及其抗冻保护作用

论文摘要

乳酸菌在食品工业中扮演者重要角色，参与许多个发酵过程。作为牛乳中检出率最高的菌——乳酸乳球菌（L．lactis subsp．lactis），有较强的产酸力及蛋白质分解能力，对多种链球菌、葡萄球菌、芽孢菌、乳杆菌有抑制作用。在干酪、发酵奶油、奶酪的发酵剂中经常使用。因此对其发酵后冷却及冷冻保藏过程中的存活率的研究至关重要。目前，国内有很多机构和学者是从研究保护剂等外部条件的保护作用的角度出发，而对乳酸菌自身抵抗环境变化的保护机制研究较少。有一明显现象大多数微生物（包括乳酸菌）都能适应比其最佳生长温度低得多的低温环境，诱导产生一系列分子质量7kDa左右的蛋白质，这一系列蛋白质被称为冷应激蛋白，它们一般由68到74个氨基酸构成，都存在5个反平行β折叠股的β桶状片层结构。它们的主要功能是作为RNA分子伴侣（RNA chaperone）与mRNA结合，阻止mRNA二级结构形成，促进翻译。本课题主要针对乳酸乳球菌中冷应激蛋白。研究了不同冷处理条件下冷诱导蛋白产生及对菌体抗冻特性的影响，并通过NICE系统高效表达冷应激蛋白CspC、CspD基因，进一步证实了CSPs的作用。课题主要分为以下几部分：1．通过Arrhenius的建立，确定了对乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.013冷处理的两个温度区间，分别为：28℃～13℃之间和小于13℃。2．10℃保持4h的冷处理，使菌体冻融存活率较未处理的空白样增加了200倍以上，而加入氯霉素的对照组存活率接近于或低于未处理的空白样。初步推断可能是氯霉素抑制了某种蛋白合成，而这种新合成的蛋白在低温条件下被诱导表达，保护细胞，使菌体获得抗冻特性。3．通过SDS-PAGE电泳，发现冷处理样有两条分子量为分子量分别为7.3、6.1kDa的蛋白，初步确定为冷应激蛋白。4．利用PCR技术获得乳酸乳球菌乳酸亚种KLDS4.013中冷应激蛋白CspC、CspD的基因片段。5．利用NICE系统高效表达冷应激蛋白CspC、CspD基因并对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析，得出CspC、CspD的相对分子量分别为7、6.2kDa。6．为了确定冷应激蛋白CspC、CspD的作用，做了三个实验：1)测定30℃菌体的生长曲线；2)菌体生长到对数期中期(OD600=0.8)，转至7℃培养，测定低温刺激对菌体生长影响；3)测定4个循环的冻-溶试验的活菌数。通过空白菌株与重组菌株的比较，可以得出：CspC使菌体更加迅速的恢复了生长；冷应激蛋白CspD增强了菌体的抗冻存活率（增加了30-40倍）。本课题的研究结果表明冷处理能提高菌体抗冻存活率，并发现了在冷处理条件下有7kDa左右的冷休克蛋白的合成，这为乳酸菌中冷应激蛋白对低温受损伤菌体的改善作用提供了理论依据。利用NICE系统高效表达冷应激蛋白CspC、CspD基因，试验证实：CspC使菌体更加迅速的恢复了生长；CspD增加了菌体冷冻存活率，但这种蛋白不是决定菌体抗冻性的唯一因素。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 引言
• 1.1 乳酸菌
• 1.1.1 乳酸菌的简介
• 1.1.2 乳酸菌的生理功能
• 1.1.3 乳酸菌的分子遗传和基因工程
• 1.2 冷应激蛋白的研究
• 1.2.1 冷应激蛋白的研究史
• 1.2.2 冷休克蛋白结构与功能
• 1.2.3 冷休克蛋白表达的调控机制
• 1.2.4 乳酸菌中冷激反应的研究及应用
• 1.3 研究的目的及意义
• 1.4 主要研究内容
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 质粒与载体
• 2.1.3 PCR引物
• 2.1.4 工具酶和试剂盒
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 缓冲液与试剂
• 2.1.7 主要生化试剂及来源
• 2.1.8 仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌种的活化与传代
• 2.2.2 乳酸菌在不同温度生长速度和温度关系的Arrhenius曲线的建立
• 2.2.3 冷诱导对乳酸菌抗冻特性的影响
• 2.2.4 乳酸菌全蛋白电泳
• 2.2.5 CspC、CspD基因在NICE系统中的高效表达
• 2.2.6 CspC、CspD的作用的研究
• 3. 结果与分析
• 3.1 乳酸乳球菌在不同温度生长速度和温度关系的Arrhenius曲线的建立
• 3.2 冷诱导对乳酸菌抗冻特性的影响
• 3.3 乳酸菌全蛋白电泳图
• 3.4 CspC、CspD基因在NICE系统中的高效表达
• 3.4.1 乳酸乳球菌总DNA提取
• 3.4.2 PCR扩增 CspC、CspD基因
• 3.4.3 CspC、CspD基因的克隆
• 3.4.4 CspC、CspD基因在NICE系统中的高效表达
• 3.5 CspC、CspD作用的研究
• 3.5.1 CspC、CspD的超量表达对菌体生长恢复的影响
• 3.5.2 低温刺激对 CSPs的超量表达的菌体的生长的影响
• 3.5.3 CspC、CspD的超量表达对菌体抗冻特性的影响
• 4. 讨论
• 4.1 低温预处理对乳酸菌抗冻特性的影响
• 4.2 冷应激蛋白基因的克隆
• 4.3 冷应激蛋白基因的表达
• 4.4 冷应激蛋白作用的研究
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文