论文摘要
人类免疫缺陷病毒I型（human immunodeficiency virus type I, HIV-1）的pol基因编码的三种酶:逆转录酶（reverse transcriptase, RT）,蛋白酶（protease,PR）和整合酶（integrase, IN ）。IN的主要功能是将病毒cDNA整合到宿主细胞的基因组DNA中,另外它亦在病毒RNA基因的逆转录及整合前复合物的进核转运过程中起作用。在对艾滋病（acquired immune deficiency syndrome, AIDS）的治疗过程中,由于传统抗RT及抗PR等药物的高毒性,易引起代谢紊乱以及抗药病毒株的出现,渐渐显示出它们的局限性。因此, IN及其与宿主细胞因素间相互作用成为AIDS治疗研究的新热点。在对HIV-1 C端功能的研究中发现,它可以与DNA非特异性结合,与宿主细胞转运因子importin7相互作用,在病毒RNA基因的逆转录、整合等HIV-1复制中的多个阶段起作用。目前对IN的研究多采用“突变分析”的方法,但此方法可能会改变IN的构象。通过“单克隆抗体”的方法来研究IN,可以在不改变IN的前提下,通过其与IN相互作用来反映IN的结构与功能,所以具有独特的优势。目前的研究已经发现IN与importin7的特异性作用位点位于IN的CTD,但是未见关于importin7与IN作用位点的研究报道。基于此,本研究第一部分应用杂交瘤技术制备了抗IN第142-288位氨基酸蛋白的单克隆抗体;第二部分应用细胞基础上共免疫沉淀的方法探讨了IN与importin7片段蛋白间的相互作用。本研究旨在为HIV-1 IN的结构、功能及开发抗HIV-1 IN的药物或疫苗打下基础。本研究第一部分,构建了HIV-1 IN第142-288位氨基酸的谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase ,GST）标签的融合蛋白表达质粒pGEX-4T1-GST- IN142-288,在原核表达系统中进行表达后纯化了融合蛋白GST-IN142-288。纯化了两种用于筛选杂交瘤克隆的野生型IN融合蛋白:His-IN与T7-IN。以GST-IN142-288作为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备了表达单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）的杂交瘤克隆。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno-sorbent Assay , ELISA ） , Western-blot （ WB ） ,免疫沉淀（Immuno-precipitation ,IP）及免疫荧光染色的方法对mAbs进行检测。结果显示,共制备了45个ELISA阳性的杂交瘤克隆,其中有12个克隆WB与IP阳性, 3个克隆免疫荧光染色阳性。对12个WB与IP阳性的克隆分泌的mAb进行亚型测定,结果显示重链亚型中3个为IgG1,6个为IgG2a, 2个为IgG2b, 1个为IgM;所有的轻链亚型均为κ。本研究的第二部分探讨IN与importin7的相互作用。构建了表达importin7第207-836位氨基酸及第442-836位氨基酸融合蛋白的质粒sVCMVin-T7-Imp7 207-836和sVCMVin-T7-Imp7 442-836。将上述两个质粒分别与表达野生型HIV-1 IN的质粒CMV-YFP-IN共转染HEK-293T细胞,采用细胞基础上共免疫沉淀（cell-based co-IP）的方法对两种importin7融合蛋白与YFP-IN融合蛋白间的相互作用进行研究。结果显示T7-importin7 207-836与T7-imp7 442-836均能与YFP-IN相互作用。提示IN与importin7相互作用的位点可能位于importin7的中间区域,至少一个位点位于第442-836位氨基酸之间。
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标签：人类免疫缺陷病毒论文; 整合酶论文; 单克隆抗体论文;