环孢菌素A抑制胰岛素分泌的分子机制研究

论文摘要

目的移植后糖尿病（post-transp1antation diabetes mellitus,PTDM）是器官移植的常见并发症。免疫抑制剂治疗是PTDM发病的危险因素之一,它们可能通过增加胰岛素抵抗、降低胰岛素分泌以及增加胰岛β细胞凋亡等途径引起PTDM。我们的前期研究表明,P糖蛋白编码基因（abcb1）产物,小P糖蛋白（mini P-glycoprotein）,具有调节胰岛素释放的生物功能,而它的特异性抑制剂—环孢菌素A（Cyclosporine A,CsA）极有可能通过这一途径影响胰岛素分泌。本研究通过体外和体内实验探索CsA抑制两相胰岛素分泌的多种分子机制,并且对小P糖蛋白途径进行初步研究。方法体外实验:（1）经胆管不离体灌注胶原酶V消化分离Wistar大鼠胰岛,分离原代a细胞和B细胞,通过共聚焦显微镜观察小P糖蛋白在各种细胞中的表达。（2）分离大鼠胰岛,CsA（0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml）干预不同的时间后,丫啶橙/碘化丙锭（AO/PI）染色,荧光显微镜下观察胰岛形态学变化,未经CsA处理的胰岛作为对照组。（3）对照组及1.0μg/mlCsA干预组分别孵育胰岛6小时和24小时后,进行胰岛素释放实验。（4）对照组、1.0μg/ml CsA和5.Oμg/ml CsA干预组分别孵育胰岛6小时及24小时后,实时定量PCR探测P糖蛋白基因（abcb1b）、凋亡基因（casp3、Bcl-2）、pdx1、胰岛素基因（ins1、ins2）和胰高血糖素基因（glucagon）表达量的变化。体内实验:（1）雄性SD大鼠200g左右,每日10mg/kgCsA皮下注射2周后,尾尖取血检测空腹血糖,腹腔注射葡萄糖2.0g/kg后,监测30min、60min、120min血糖,观察CsA对大鼠整体血糖的影响。生理盐水皮下注射组作为对照。（2）摘取大鼠胰腺,常规固定、包埋、切片和HE染色,显微镜下观察组织形态学变化。（3）不离体胰腺灌流实验观察基础胰岛素和高糖刺激胰岛素分泌的变化。（4）分离大鼠胰岛,提取总RNA,实时定量PCR探测abcb1b、casp3、Bcl-2、ins1、ins2、glucagon表达量的变化。结果体外实验:（1）在胰岛中,小P糖蛋白主要表达在B细胞中,a细胞中未见表达。胰岛素颗粒和小P糖蛋白有部分共定位。（2）挑选形态规则的胰岛进行AO/PI染色,于荧光显微镜下观察,活的胰岛组织呈现绿色荧光,死亡的呈现红色荧光。0.5μg/ml CsA、1.0μg/ml CsA孵育6小时、24小时、48小时胰岛形态与对照组相比均无明显变化,胰岛呈椭圆形,边界清楚。2.5μg/ml CsA孵育6小时、24小时后,与对照组相比无明显变化,48小时后红色荧光明显较对照组增多,但胰岛形态仍呈椭圆形,边界清楚。5.0μg/mlCsA干预6小时未见差异,24小时后呈椭圆形,边界稍模糊,48小时后包膜破坏,细胞坏死呈红色荧光。10μg/mlCsA孵育6小时无明显变化,24小时后边界模糊,48小时后包膜崩解,呈碎片状。（3）胰岛素释放实验中,CsA干预6小时和24小时后,胰岛素的一相分泌均未受影响,二相分泌较对照组均明显下降。(41.0μg/ml CsA和5.0μg/ml CsA 干预 6 小时和 24 小时后,abcb1b、ins1、ins2、pdx1、glucagon、casp3 表达量与对照组相比均无变化;Bcl-2基因在6小时后表达量无变化,24小时后两组表达均下调。体内实验:（1）葡萄糖耐量实验30min血糖实验组明显高于对照组,其余各时间点两组比较未见差异;病理切片结果显示:实验组胰腺组织与对照组相比,未见细胞变性、坏死及纤维化;不离体胰腺灌流实验显示:基础胰岛素分泌未见差异,高糖刺激后胰岛素分泌中一相、二相均下降。abcb1b、ins1、ins2、glucagon、及casp3基因表达量均无变化,Bcl-2基因表达量明显下调。结论（1）小P糖蛋白主要分布在胰岛的β细胞内,有可能在胰岛素颗粒膜上表达。（2）CsA对胰岛的毒性作用呈剂量和时间依赖性。体外小剂量CsA短时间干预抑制胰岛素第二相分泌,而该抑制作用与胰岛素合成及β细胞凋亡无关。但是随着时间和剂量的增加,凋亡可能发挥主要作用。CsA的抑制作用与小P糖蛋白的表达无关,但是通过药理性阻断抑制小P糖蛋白调节胰岛素分泌功能的可能性不能排除。（3）体内实验显示,CsA干预未对胰腺造成明显的组织病理学改变。CsA显著抑制了胰岛素的两相分泌,其主要的病理机制可能是B细胞凋亡。（4）CsA通过多种途径造成胰岛素分泌受损,从而导致PTDM的发生。（5）由于CsA对胰岛素分泌有确切的抑制作用,临床上胰岛功能尚存的糖尿病病人应用CsA治疗时应慎重选择治疗剂量和时间。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、环孢菌素A影响大鼠两相胰岛素分泌的体外研究
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 研究对象
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 胰岛及a、β原代细胞免疫组化结果
• 1.2.2 胰岛AO/PI染色结果
• 1.2.3 两相胰岛素分泌
• 1.2.4 环孢菌素A干预后基因表达量的变化
• 1.3 讨论
• 1.3.1 环孢菌素A干预后胰岛形态学改变
• 1.3.2 胰岛素的合成、储存及释放
• 1.3.3 环孢菌素A与胰岛素分泌
• 1.3.3.1 环孢菌素A与P糖蛋白
• 1.3.3.2 环孢菌素A与细胞凋亡
• 1.3.3.3 环孢菌素A与胰岛素、胰高血糖素合成
• 1.3.3.4 其他
• 1.4 小结
• 二、环孢菌素A影响大鼠两相胰岛素分泌的体内研究
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 研究对象
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 注射环孢菌素A4周后体重变化
• 2.2.2 注射环孢菌素A4周后血糖变化
• 2.2.3 注射环孢菌素A4周后胰岛素变化
• 2.2.4 注射环孢菌素A2周后体重、血糖变化
• 2.2.5 注射环孢菌素A2周后胰腺病理切片结果
• 2.2.6 注射环孢菌素A2周后腹腔注射糖耐量实验结果
• 2.2.7 注射环孢菌素A2周后不离体胰腺灌流结果
• 2.2.8 注射环孢菌素A2周后实时定量PCR结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 环孢菌素A与胰岛素分泌
• 2.3.2 电压门控钙通道与胰岛素分泌
• 2.3.3 胰岛素分泌受损的分子机制
• 2.3.4 环孢菌素A与糖尿病治疗
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述 有关ClC-3通道与酸化机理的研究
• 综述参考文献
• 致谢