龙须菜热激蛋白70（HSP70）基因克隆及热激下的表达模式分析

论文摘要

龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）是一种产琼胶的重要经济红藻,原产地为山东省和辽宁省,现在广东、福建、浙江等地已成功实现南移栽培。南移栽培的龙须菜品系主要为981龙须菜,其适应海水温度可达26°C,但其在南方自然海域仍不能成功渡夏,因此培育耐高温龙须菜新品系,研究龙须菜的高温胁迫响应机制一直是研究者关注的问题。热激蛋白（HSPs）是一类在生物体受到逆境胁迫时能提高机体耐受性的逆境蛋白家族,在减轻逆境胁迫对机体的伤害方面起到很大作用。HSP70是其重要组成成员,是提高生物体对温度耐受力的关键因子之一。本实验室前期通过构建龙须菜高温胁迫差异表达的cDNA文库,筛选得到了高丰度的龙须菜hsp70基因的表达序列标签,表明HSP70在龙须菜的高温胁迫响应中也起重要作用。本研究以耐高温品种981龙须菜和野生型龙须菜为主要材料,采用RACE技术和Genome Walking方法对龙须菜热激蛋白hsp70进行克隆,首次在龙须菜中获得两条hsp70基因（hsp70-1和hsp70-2）全长序列,推测得到其相应的氨基酸序列,并通过生物信息学的方法分析二者的结构特征和进化地位,使用荧光定量RT-PCR技术探讨981和野生型龙须菜在不同温度不同胁迫时间下,热激蛋白HSP70 mRNA表达水平的变化规律。主要研究结果如下:获得两条hsp70基因序列（hsp70-1和hsp70-2）,均含有三个典型的HSP70家族的序列标签,且5’非编码区域（UTR）有TATA Box和CAAT Box,3’UTR区有PolyA寡聚腺甘酸。其中,hsp70-1基因全长2582bp,仅由一个外显子组成,开放阅读框（ORF）长1977bp,编码658个氨基酸,分子量约为71.69kD,5’UTR为484bp,3’UTR区为121bp,其中5’UTR含有热激元件HSE。hsp70-2基因全长2843bp,也由一个外显子组成,ORF为2001bp,编码666个氨基酸,分子量约为72.88kD,5’UTR区730bp,3’UTR区112bp,有内质网定位序列HDEL。经NCBI Blastn比对二者的核苷酸相似性为69%,同源性比对表明,龙须菜HSP70-1与条斑紫菜（Pophyra yezoensis）HSP70同源性最高,为92%;龙须菜HSP70-2与领鞭毛虫（Monosiga brevicollis）MbERHSP70同源性最高,为77%。热激后（28°C和32°C）,进行Real-time PCR结果表明:野生型实验组HSP70-1在热激短时间内表达量有所上升,而HSP70-2表达量始终低于对照组,且32°C实验组比28°C实验组表达量更低;981龙须菜实验组两种热激蛋白均呈现先上升后下降又上升的趋势,热激温度越高,表达高峰到来的越早,表达量更大,而且随着热激时间延长,表达量将更高。HSP70-1的表达水平高于HSP70-2,推测在龙须菜受热激胁迫过程中,HSP70-1发挥主导作用。综合比较野生型龙须菜和耐高温品种981龙须菜在高温胁迫下HSP70的表达情况,可以看出981龙须菜热激蛋白HSP70表达水平明显高于野生型龙须菜,而且表达持续时间更长,这可能与981龙须菜的耐高温性能更强直接相关。该研究结果为研究龙须菜高温胁迫响应机制提供了分子基础,为龙须菜耐高温品种选育提供了可用的基因信息。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 龙须菜的价值及养殖现状
• 2 植物抗高温性响应机制
• 2.1 抗氧化系统对高温的响应
• 2.2 信号传导系统对高温的响应
• 2.3 热激蛋白对高温的响应
• 2.4 内渗调节物质对高温的响应
• 2.5 其他因子对高温的响应
• 3 植物热激蛋白HSPs概述
• 3.1 热激蛋白HSPs 的分类及分布
• 3.2 热激蛋白HSPs的结构特点
• 3.3 热激蛋白HSP70 的特点
• 3.4 HSP70 的表达调控
• 3.5 HSP70 的功能
• 4 藻类热激蛋白HSPs 研究进展
• 5 本论文研究目的及意义
• 第二章 龙须菜热激蛋白hsp70-1基因克隆与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与实验仪器
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 龙须菜RNA 提取
• 2.2 龙须菜DNA 提取
• 2.3 龙须菜热激蛋白hsp70-1 cDNA 扩增
• 2.4 龙须菜热激蛋白hsp70-1 基因组序列及启动子扩增
• 2.5 龙须菜热激蛋白hsp 70-1 基因序列分析
• 2.6 龙须菜HSP70-1 氨基酸分析
• 2.7 HSP70-1 空间结构预测
• 2.8 野生型与981 型龙须菜hsp70-1 基因序列比较与分子系统学分析
• 3 讨论
• 第三章 龙须菜热激蛋白hsp70-2基因克隆与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与实验仪器
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 龙须菜热激蛋白hsp70-2 cDNA 扩增
• 2.2 龙须菜热激蛋白hsp 70-2 基因组序列及启动子扩增
• 2.3 龙须菜热激蛋白hsp70-2 基因序列分析
• 2.4 龙须菜HSP70-2 氨基酸分析
• 2.5 HSP70-2 空间结构预测
• 2.6 野生型与981型龙须菜hsp70-2基因序列比较与分子系统学分析
• 2.7 龙须菜hsp70-1与hsp70-2基因序列和氨基酸比较分析
• 2.8 龙须菜HSP70-1和HSP70-2系统进化分析
• 3 讨论
• 第四章 高温胁迫下龙须菜热激蛋白70 m RNA表达水平研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与实验仪器
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA 提取质量
• 2.2 引物检测结果
• 2.3 高温胁迫下野生型龙须菜热激蛋白HSP70-1和HSP70-2表达结果与分析
• 2.4 高温胁迫下981型龙须菜热激蛋白HSP70-1和HSP70-2表达结果与分析
• 3 讨论
• 第五章 总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文