嗜热毛壳菌热稳定超氧化物歧化酶的纯化及基因克隆和表达

论文摘要

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,简称SOD）（EC.1.15.1.1）系一类金属酶,广泛存在于生物体中。它能够催化超氧阴离子（O2.-）发生歧化反应,从而清除超氧阴离子。在生物体防御氧化损伤的过程中,发挥着重要作用。根据酶分子中所含金属辅基的不同,超氧化物歧化酶主要可分为CuZn-SOD（存在于真核生物中）,Mn-SOD（存在于原核生物和真核生物中）,Fe-SOD（存在于原核生物和高等植物的叶绿体中）等类型。Mn-SOD和Fe-SOD的氨基酸组成相似,可能起源于同一祖先。嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）是一种广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,从该菌中已分离了多种嗜热酶,但未见超氧化物歧化酶的报道。本研究中C. thermophilum在含干酪素的合成培养基中生长产生超氧化物歧化酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳条带均一的超氧化物歧化酶。分别用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的方法和Sephacryl S-100凝胶过滤层析的方法,测定出本研究所获得的超氧化物歧化酶的分子量分别为23.5kDa和94.4kDa,证明在本研究中所得到的超氧化物歧化酶是一种由4个相同的亚基所构成的蛋白质。本研究所得到的超氧化物歧化酶的反应最适pH值为7.5,酶的反应最适温度为60℃。在pH值为7.5的条件下,该酶在50℃和60℃时保温1h是基本稳定的,在70℃时保温1h后,仍保留有60%的酶活性;在80℃时,酶的半衰期约为25min。C. thermophilum超氧化物歧化酶（Mn-SOD） N-端10个氨基酸序列为KATLPDLKYD,与Aspergillus fumigatus和Paracoccidioides brasiliensis超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的N-端氨基酸序列有较高的同源性。根据超氧化物歧化酶的氨基酸保守序列设计兼并引物,克隆了C. thermophilum热稳定超氧化物歧化酶CuZn-SOD和Mn-SOD的基因,随后提取C. thermophilum的基因组DNA,克隆了CuZn-SOD DNA序列,该序列包含三个内含子区域。这三个基因在GenBank中的注册号分别为DQ493760、EF569987、DQ683184。将超氧化物歧化酶的基因cz1与酵母表达载体pPIC9K用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后体外连接构建了酵母分泌型表达载体pPIC9K/cz1,转化巴斯德毕赤酵母获得了转酵母工程菌GS-CZ-10,酶蛋白表达量为0.56mg/mL,同时对重组超氧化物歧化酶的性质进行了研究。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1. 引言
• 2. 超氧化物歧化酶的研究进展
• 2.1 SOD 的分布与类型
• 2.2 SOD 的结构和性质
• 2.2.1 SOD 的结构
• 2.2.1.1 SOD 的一级结构
• 2.2.1.2 SOD 的高级结构
• 2.2.2 SOD 的理化性质
• 2.2.2.1 SOD 是亲水性的蛋白质
• 2.2.2.2 SOD 的紫外吸收
• 2.2.2.3 金属辅基与酶活性
• 2.2.2.4 SOD 的还原和失活作用
• 2.2.2.5 SOD 的免疫原性
• 2.2.2.6 电离辐射对SOD 的影响
• 2.2.2.7 磁场对SOD 的影响
• 2.3 SOD 的分子生物学
• 2.3.1 SOD 编码的基因
• 2.3.2 SOD 的基因克隆和表达
• 2.3.3 SOD 的基因表达调控
• 2.4 SOD 的应用
• 2.4.1 SOD 在临床及工业上的应用
• 2.4.2 SOD 在农业领域的应用
• 3. 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展
• 3.1 基因表达系统概述
• 3.2 巴斯德毕赤酵母的特性
• 3.3 毕赤酵母宿主菌和表达载体的类型
• 3.4 表达载体在毕赤酵母中的整合
• 3.5 巴斯德毕赤酵母中信号肽的剪切过程
• 4. 本研究的立题依据、研究内容和技术路线
• 4.1 立题依据
• 4.2 研究内容
• 4.3 技术路线
• 第二章 嗜热毛壳菌（CHAETOMIUM THERMOPHILUM）超氧化物歧化酶的分离纯化及特性研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.2.1 固体PDA 培养基（马铃薯琼脂培养基）
• 1.1.2.2 液体Casein 培养基
• 1.1.3 主要仪器和试剂
• 1.1.3.1 仪器设备
• 1.1.3.2 试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 液体发酵培养
• 1.2.2 不同培养时间对超氧化物歧化酶产生的影响
• 1.2.3 酶活性测定
• 1.2.3.1 测定方法
• 1.2.3.2 酶的活力单位（U）
• 1.2.4 蛋白质含量测定
• 1.2.5 超氧化物歧化酶的分离纯化
• 1.2.5.1 粗酶液的制备
• 1.2.5.2 硫酸铵沉淀
• 1.2.5.3 DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析
• 1.2.5.4 Phenyl-Sepharose 疏水柱层析
• 1.2.6 纯度鉴定
• 1.2.6.1 电泳操作步骤
• 1.2.6.2 溶液的配制
• 1.2.7 分子量的测定
• 1.2.7.1 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量
• 1.2.7.2 凝胶过滤层析测定蛋白质分子量
• 1.2.8 SOD 的非变性电泳（PAGE）及电泳的活性染色
• 1.2.8.1 SOD 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• 1.2.8.2 SOD 的活性染色
• 1.2.8.3 凝胶的配制
• 1.2.9 超氧化物歧化酶性质的研究
• 1.2.9.1 SOD 的反应最适温度
• 1.2.9.2 SOD 的反应最适pH 值
• 1.2.9.3 SOD 的热稳定性
• 1.2.9.4 SOD 的pH 值稳定性
• 1.2.10 N-端氨基酸序列分析
• 1.2.11 SOD 种类的测定
• 2. 结果与分析
• 2.1 不同培养时间对产生超氧化物歧化酶的影响
• 2.2 C. thermophilum 超氧化物歧化酶的分离纯化及鉴定
• 2.2.1 DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析
• 2.2.2 Phenyl-Sepharose 疏水柱层析
• 2.2.3 超氧化物歧化酶纯化过程总表
• 2.3 超氧化物歧化酶的一般性质
• 2.3.1 SOD 的分子量
• 2.3.2 SOD 的最适反应温度
• 2.3.3 SOD 的最适反应pH 值
• 2.3.4 SOD 的热稳定性
• 2.3.5 SOD 的pH 值稳定性
• 2.4 N-端氨基酸序列测定
• 2.5 SOD 种类的测定
• 3. 讨论
• 3.1 研究结果
• 3.2 研究方法
• 3.3 今后还应开展的工作
• 第三章 嗜热真菌超氧化物歧化酶的基因克隆及其序列分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 菌株与质粒
• 1.1.3 酶和生化试剂
• 1.1.4 仪器
• 1.1.5 培养基
• 1.1.6 溶液配制
• 1.2 嗜热真菌Mn-SOD 基因的cDNA 克隆
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 总RNA 的提取（ Trizol 法）
• 1.2.3 紫外检测RNA 产率和纯度
• 1.2.4 反转录cDNA 第一链的合成
• 1.2.5 目的基因cDNA 中间片段的分离
• 1.2.5.1 目的基因cDNA 中间片段的扩增
• 1.2.5.2 PCR 产物回收
• 1.2.5.3 与载体连接
• 1.2.5.4 E.coli 感受态细胞的制备和转化
• 1.2.5.5 重组质粒的筛选与鉴定
• 1.2.5.6 序列测定
• 1.2.6 目的基因3’末端的分离
• 1.2.6.1 疏绵状嗜热丝孢菌Mn-SOD 基因3’末端的分离
• 1.2.6.2 嗜热毛壳菌Mn-SOD 基因3’末端的分离
• 1.2.7 目的基因5’末端的分离
• 1.2.7.1 cDNA 第一链的合成
• 1.2.7.2 cDNA 第一链的纯化
• 1.2.7.3 cDNA 第一链的加尾
• 1.2.7.4 RACE-PCR 扩增
• 1.2.7.5 二次PCR（巢式PCR）
• 1.2.8 目的基因全长cDNA 的克隆
• 1.2.9 全长序列的生物信息学分析
• 1.3 嗜热毛壳菌CuZn-SOD 基因的cDNA 和Genomic DNA 的克隆及序列分析
• 1.3.1 引物设计
• 1.3.2 目的基因cDNA 中间片段的扩增
• 1.3.3 目的基因3’末端的分离
• 1.3.4 目的基因全长cDNA 的克隆
• 1.3.5 全长序列的生物信息学分析
• 1.3.6 嗜热毛壳菌CuZn-SOD Genomic DNA 的克隆及序列分析
• 1.3.6.1 菌丝体DNA 的抽提
• 1.3.6.2 嗜热毛壳菌Genomic DNA PCR 扩增
• 1.3.6.3 CuZn-SOD 的DNA 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 C. thermophilum 和T. lanuginosus 总RNA 的提取
• 2.2 嗜热真菌Mn-SOD 基因的分离
• 2.2.1 Mn-SOD 基因中间片段的分离
• 2.2.2 T. lanuginosus Mn-SOD 基因cDNA 3’-末端的分离及序列分析
• 2.2.3 C. thermophilum Mn-SOD 基因cDNA 3’-末端的分离
• 2.2.4 C. thermophilum Mn-SOD 基因cDNA 5’-末端的分离
• 2.2.5 C. thermophilum Mn-SOD 基因全长cDNA 的分离及扩增片段的序列拼接
• 2.2.6 C. thermophilum Mn-SOD 基因的核苷酸和氨基酸序列分析
• 2.2.6.1 Mn-SOD 基因的核苷酸序列分析
• 2.2.6.2 Mn-SOD 基因的氨基酸序列分析
• 2.3 嗜热毛壳菌CuZn-SOD 基因的分离
• 2.3.1 C. thermophilum CuZn-SOD 基因中间片段的分离
• 2.3.2 C. thermophilum CuZn-SOD 基因cDNA 3’-末端的分离
• 2.3.3 C. thermophilum CuZn-SOD 基因全长cDNA 的分离及扩增片段的序列拼接
• 2.3.4 嗜热毛壳菌CuZn-SOD Genomic DNA 的扩增
• 2.3.5 C. thermophilum CuZn-SOD 基因的核苷酸和氨基酸序列分析
• 2.3.5.1 CuZn-SOD 基因的核苷酸序列分析
• 2.3.5.2 CuZn-SOD 基因的氨基酸序列分析
• 3. 讨论
• 第四章 嗜热毛壳菌CUZN-SOD 基因在毕赤酵母中的表达
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 培养基及有关溶液的配制
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 CuZn-SOD 成熟肽基因序列的分离
• 1.2.1.1 CuZn-SOD 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析
• 1.2.1.2 引物设计和CuZn-SOD 成熟肽基因序列的分离
• 1.2.2 CuZn-SOD 基因在毕赤酵母中的表达
• 1.2.2.1 酵母表达载体的构建
• 1.2.2.2 线性化质粒DNA 的制备
• 1.2.2.3 酵母转化
• 1.2.2.4 酵母转化子的筛选与鉴定
• 1.2.2.5 酵母转化子的PCR 鉴定
• 1.2.2.6 外源基因多拷贝整合转化子筛选
• 1.2.2.7 酵母工程菌的培养和CuZn-SOD 的诱导分泌表达
• 1.2.2.8 表达产物的生物学活性检测
• 1.2.2.9 表达产物CuZn-SOD 的SDS-PAGE 分析
• 1.2.2.10 超氧化物歧化酶工程菌产酶曲线的测定
• 1.2.2.11 超氧化物歧化酶工程菌的遗传稳定性分析
• 1.2.2.12 超氧化物歧化酶工程菌表达产物的酶学性质
• 2. 结果与分析
• 2.1 CuZn-SOD 成熟肽基因序列的分离
• 2.1.1 CuZn-SOD 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析结果
• 2.1.2 CuZn-SOD 成熟肽基因序列的分离
• 2.2 超氧化物歧化酶基因 cz1 在毕赤酵母中的表达
• 2.2.1 酵母表达载体的构建和鉴定
• 2.2.2 重组酵母表达质粒pPIC9K/cz1 转化 Pichia pastoris GS115 及酵母转化子的筛选
• 2.2.2.1 酵母转化子的甲醇利用表型的筛选
• 2.2.2.2 酵母转化子的PCR 鉴定
• 2.2.2.3 cz1 基因多拷贝整合子的筛选
• 2.2.3 嗜热毛壳菌热稳定超氧化物歧化酶 cz1 基因在 Pichia pastoris 中的高 效表达及表达产物的检测
• 2.2.3.1 超氧化物歧化酶 cz1 基因在 Pichia pastoris 中的诱导表达和高表达 酵母菌株的筛选
• 2.2.3.2 超氧化物歧化酶酵母工程菌产酶曲线的测定
• 2.2.3.3 甲醇的体积分数对超氧化物歧化酶产量的影响
• 2.2.3.4 超氧化物歧化酶基因 cz1 表达产物的 SDS-PAGE 检测
• 2.2.4 超氧化物歧化酶酵母工程菌的遗传稳定性分析
• 2.2.5 表达超氧化物歧化酶CuZn-SOD 的酶学性质研究
• 2.2.5.1 表达超氧化物歧化酶CuZn-SOD 的最适反应温度
• 2.2.5.2 表达超氧化物歧化酶CuZn-SOD 的最适反应pH 值
• 2.2.5.3 表达超氧化物歧化酶CuZn-SOD 的热稳定性
• 2.2.5.4 表达超氧化物歧化酶CuZn-SOD 的pH 稳定性
• 3 讨论
• 3.1 影响Pichia pastoris 表达系统表达重组超氧化物歧化酶的因素
• 第五章 结论和建议
• 1 结论
• 2 建议
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况