茄科尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白基因转化体系的优化及其定殖特性的研究

论文摘要

茄科枯萎病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的毁灭性病害,严重制约了我国茄科作物的生产。本文从福建省各地区采集了番茄、茄子及辣椒枯萎病植株,分离与鉴定了其病原菌;并对一株番茄枯萎病菌进行绿色荧光蛋白（GFP）基因转化,筛选获得了荧光强度和遗传性状稳定的转化子,同时利用绿色荧光蛋白标记的转化子研究了番茄枯萎病原菌在植株体内及根际土内的定殖特性,主要研究结果如下:1.从福建省的漳州、福州、厦门等茄科作物主产区采集了番茄、辣椒、茄子表现枯萎病症状的植株进行分离鉴定,获得40株镰刀菌,其中35株为尖孢镰刀菌,进一步的致病性确定了尖孢镰刀菌是这3种茄科作物枯萎病的致病菌株。2.采取CaCl2-PEG介导的方法,优化番茄尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白（GFP）转化体系。转化的最适条件:培养12-14 h的新鲜菌丝在4 mL裂解液（20 mg/mL崩溃酶,10 mg/mL溶壁酶）中,28℃,70 r/min条件下,酶解2.5-3 h。对所得转化子的生物学特性研究表明,标记后的菌株在菌丝形态、生长速度、PH值等条件下的生长特性与野生型菌株基本相同。通过稳定性筛选获得了荧光强度、遗传性状稳定的转化子。3.利用激光共聚焦扫描显微镜跟踪观察了绿色荧光蛋白标记菌株在番茄植株内的侵染特性,结果表明,处理后的第3 d、第6 d时,可见分子孢子萌发后从植株的根系侵入,此时植株的地上部无明显变化;第10 d时,菌丝体已到达植株的根系及茎基部维管束组织,植株的根及茎基部出现褐变现象;第17 d时,植株茎基部的菌丝量增多,番茄植株个别枝条萎焉,且茎基部出现了明显的褐变。4.跟踪观察了gfp基因标记菌株在不同性质土壤中的32天的定殖情况,结果表明,标记菌株能够在不同性质的土壤内至少定殖1个月,随着时间的延长其定殖密度逐渐下降。其中在水稻田土里存活能力最好,在沙土里存活能力最差。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1. 茄科枯萎病的发生与危害
• 1.1 茄科枯萎病的分布
• 1.2 发生原因
• 1.3 传播危害
• 1.4 发病规律
• 2. 茄科枯萎病的病原菌
• 3. 茄科枯萎病的防治
• 4. G FP 及其在丝状真菌中的研究概况
• 4.1 GFP 基础理论研究概况
• 4.2 GFP 作为标记物所具有的优点
• 4.3 GFP 在丝状真菌研究中的应用
• 5. 本研究的目的及意义
• 第二章 茄科作物枯萎病原菌的分离与鉴定
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 茄科作物枯萎病害调查及其发病症状
• 2.2 茄科枯萎病菌的分离与鉴定
• 2.3 病原菌的分子鉴定
• 2.4 致病性测定结果
• 3 讨论
• 第三章 番茄尖孢镰刀菌GFP转化体系的优化
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 尖孢镰刀菌的原生质体制备
• 2.2 gfp基因的转化
• 2.3 转化子的稳定性筛选
• 3 讨论
• 第四章 番茄尖孢镰刀菌GFP 转化子的生物学特性
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 转化子的菌体形态及生长速度
• 2.2 不同PH 对转化子生长的影响
• 2.3 转化子对潮霉素的抗性水平分析
• 3 讨论
• 第五章 番茄尖孢镰刀菌在植株体内的侵染定殖
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 植株及组织发病症状观察
• 2.2 共聚焦激光扫描显微镜检测标记菌
• 3 讨论
• 第六章 番茄尖孢镰刀菌在土壤中的定殖特性
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同土壤中转gfp 基因镰刀菌的数量动态变化
• 2.2 不同土壤中转gfp 基因镰刀菌的荧光观察
• 3 讨论
• 第七章 番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PLFAs 法分析转gfp基因镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响
• 3 讨论
• 第八章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢