论文摘要
恶性肿瘤是导致人类死亡的重大疾病之一,全球每年有12.5%的死亡病例是死于癌症。目前临床所用化疗药物虽然有一定的疗效,但由于其作用靶向性低,毒副作用较大。因此,开发高效、低毒的抗肿瘤药物仍然是当前药物研究开发的热点。嗜盐微生物具有特殊的生长环境和代谢机制,为开发具有应用价值的生物活性化合物提供了可能。中度嗜盐菌F1和F2分离自海盐场,本文通过传统的生化试验和菌株形态特征,及其ITS-5.8S rDNA序列分析,对两株真菌进行了鉴定。真菌F1属于曲霉属（Aspergillus）的一个新种,命名为Aspergillus sp.nov.F1。真菌F2属于青霉属（Penicillium）,命名为Penicillium chrysogenum F2。此外,曲霉菌F1在含有3-15%（w/v）NaCl的培养基中生长良好,随着盐度的增加,次级代谢产物的细胞毒性也随之增加。本文结合肿瘤细胞毒活性跟踪,采用硅胶柱层析,葡聚糖凝胶LH-20柱层析和重结晶对活性化合物进行分离纯化,通过1H-NMR,13C-NMR和ESI-MS谱分析鉴定化合物结构。从Aspergillus sp.nov.F1的发酵上清液和菌丝体的乙酸乙酯提取物中的分离得到3种具有细胞毒性的化合物,并确定为麦角甾醇、细胞松弛素Rosellichalasin和Cytochalasin E。从真菌F2的代谢产物中分离纯化得到2种具有肿瘤细胞毒活性的化合物,分别为Ergosterol和Meleagrin。研究发现麦角甾醇对人结肠癌细胞RKO具有较强的增殖抑制作用,IC50为3.3±0.5μM。本文研究发现Aspergillus sp.nov.F1的细胞松弛素产量高,而且发酵条件简单、经济,因此,该菌株可作为大规模制备Cytochalasin E和Rosellichalasin的发酵菌株。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成部分,是一种五环三萜类化合物。本文研究发现,新鲜配制的麦角甾醇对HeLa细胞的增殖抑制作用很弱,麦角甾醇加热转化成麦角甾醇衍生物（ED）,其细胞毒性显著增强。MTT结果显示,ED对人肿瘤细胞株显示出广泛而较强的细胞毒性,其对HeLa的IC50值为9.1±1.64μg/mL。Hoechst33258染色发现,ED能够诱导HeLa细胞凋亡。进一步研究发现,ED可抑制HeLa细胞中NF-κB的活化和核转位,呈浓度依赖性抑制NF-κB依赖的Bcl-2、Survivin、COX-2和VEGF蛋白的表达,通过NF-κB信号通路诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡。流式细胞仪检测结果发现,ED对HeLa细胞具有一定的周期阻滞作用,将其阻滞在S期;而且,ED处理后的HeLa细胞其微管蛋白的聚合受到抑制。本研究说明ED可能通过调控NF-κB信号通路来抑制HeLa细胞的增殖和诱导其凋亡。综上所述,嗜盐微生物是开发生物活性化合物的重要资源,天然产物研究仍然是寻找高效、低毒的抗肿瘤药物的重要手段。麦角甾醇衍生物具有抗瘤谱广、副作用小等优点,有希望发展成为新的抗肿瘤药物。本研究同时进行了小豆蔻明抗肿瘤作用机制研究。小豆蔻明是一种查尔酮类化合物,是一种有效的抗炎剂。对其抗肿瘤活性报道较少。本文主要研究了小豆蔻明的抗肿瘤活性及其对人结肠癌细胞增殖抑制的分子机制。MTT结果显示,小豆蔻明对人肿瘤细胞株显示出广泛而较强的细胞增殖抑制作用,对结肠癌RKO细胞的IC50值为4.25±2.96μg/mL。Annexin V/PI双染、hoechst 33342染色和基因组DNA检测发现,小豆蔻明能够诱导结肠癌RKO细胞凋亡。进一步的研究发现,小豆蔻明能够引起RKO细胞线粒体膜电位降低,诱导其胞内ROS产生,促进RKO细胞中细胞色素C从线粒体大量释放到胞质中,并进一步激活caspase-9/3,剪切PARP,从而使细胞进入线粒体凋亡通路。而且,小豆蔻明可抑制拓扑异构酶I的DNA解旋作用,对RKO细胞S期产生明显地阻滞作用。因此,天然产物仍然是寻找高效、低毒的抗肿瘤药物的重要资源。天然查尔酮小豆蔻明,毒性低,安全性好,有潜力成为一种新的抗肿瘤候选药物。