论文摘要
目的：在人类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）体外原代培养的基础上，分析和探讨三氧化二砷（AS2O3）对FLS诱导凋亡中可能发生的机制—通过激活线粒体途径，释放细胞色素C，进而活化Caspases，启动细胞内凋亡，并能够影响Bcl-2 mRNA的表达调节该途径，从而探讨AS2O3在治疗类风湿关节炎中的价值。方法：本试验双酶消化法体外培养RA患者关节滑膜细胞，在光镜、电镜、HE染色、细胞免疫组化等方法鉴定为人成纤维样滑膜细胞（HFLS），电镜、DNA凝胶电泳、流式细胞术、Caspase-3活性检测等多种手段证实一定浓度范围的AS2O3可以诱导HFLS凋亡的基础上，酶联免疫吸附测定（ELISA）定量检测不同浓度AS2O3对5例RA HFLS分别作用6、24和48小时后释放到细胞浆内的细胞色素C（CytC）含量；RT-PCR半定量检测一定浓度下的AS2O3作用HFLS48小时后细胞Caspase-3、Bcl-2 mRNA表达，探讨AS2O3诱导凋亡作用中线粒体改变带来的变化以及Bcl-2是否参与了对线粒体的调控；并用SPSS 13.0统计软件对结果进行分析。结果：1．在细胞凋亡早期，胞浆中的细胞色素C的含量即发生变化。ELISA检测不同浓度的AS2O3作用6小时后，胞浆内的CytC较空白对照组显著升高，有统计学意义。药物作用24小时后CytC含量显著增高，并且在2-40μmol／L浓度范围内其作用呈一定剂量依赖性。48小时后CytC含量在20μmol／L时较24小时增加不明显。在药物浓度为80μmol／L时，CytC含量变化与40μmol／L比较无统计学意义，推测在AS2O3剂量大的情况下可能导致细胞坏死，细胞膜崩解，而不是首先出现线粒体的改变。2．RT-PCR检测不同浓度的AS2O3作用HFLS 48小时后细胞中Caspase-3的mRNA表达显著增强，并且在2-40μmol／L浓度范围内其作用呈一定剂量依赖性，证实了线粒体中CytC等促凋亡因子的释放后激活了细胞凋亡的内部途径，这可能是AS2O3诱导HFLS凋亡的机制之一。3．RT-PCR检测发现在2-40μmol／L浓度范围内的AS2O3作用48小时后HFLS的Bcl-2基因表达较空白对照组减弱，与剂量呈负相关。Bcl-2基因表达参与了调控AS2O3对HFLS诱导凋亡过程。结论：2-40μmol／L浓度范围内的AS2O3作用HFLS均发生凋亡，与其剂量呈一定的相关性，而且提示AS2O3的凋亡诱导作用一通过激活线粒体，使CytC、AIF等促凋亡因子释放，进而Caspase-3激活途径促使人成纤维样滑膜细胞发生凋亡，并且可以降低细胞中Bcl-2基因表达，尤其是AS2O3在2-40μmol／L浓度范围内。本试验为临床治疗RA筛选用药及剂量提供参考。