亚硝胺生物降解与硝酸还原酶的纯化及其编码基因的克隆

论文摘要

烟草特有亚硝胺（TSNA,Tobacco-specific nitrosamines）是一组只存在于烟叶、烟制品和烟气中的致癌物质。其合成前体物质是烟草生物碱、硝酸盐和亚硝酸盐。许多研究表明调制前的青烟不含TSNA,TSNA的合成多在晾制后期逐步积累。烟叶中有足够的烟碱用来形成TSNA,亚硝酸盐的积累是影响TSNA积累的主要因素。在收获期绿色烟叶和烘烤前期,没有或含有少量的亚硝酸盐,亚硝酸盐在烘烤期逐渐增加并且与TSNA的积累正相关。目前已有多种方法降低TSNA的含量,但都存在一定的局限。利用微生物降解TSNA是新的研究领域。反硝化细菌（denitrifying bacteria）通过诱导产生硝酸还原酶和亚硝酸还原酶对硝酸盐和亚硝酸盐进行还原。从45个反硝化细菌菌株中筛选出具有较强反硝化作用能力的菌株,并对目的菌株的最适培养基、生长温度及好气性进行测定,为反硝化细菌的利用提供依据。以自动化学分析仪检测Giltay液体培养基中的含氮量,测定菌株的反硝化作用能力。在45个供试菌株中,B88和B237菌株能够较好地降解培养基中的硝酸盐和亚硝酸盐,产气早,速度快,3d4d产气达到高峰,含氮量明显降低,表明其反硝化作用能力较强。B88和B237菌株是好气性的,生长受氧气供应量的限制,CO2含量（20%）的提高,对菌株的生长具有较强抑制作用。在牛肉浸膏蛋白胨培养基、反硝化细菌培养基、YB培养基等培养基中,YB培养基最适合B88和B237菌株生长。B88和B237菌株最适生长温度为30℃,在YB培养基中生长的最高浓度:B88为6.1×108个/mL;B237为1.54×108个/mL。利用分子生物学技术通过菌株16S rDNA对两个菌株进行鉴定,结果两个菌株与枯草芽孢杆菌同源性很高,属于芽孢杆菌属,命名为Bacillus subtilis B88和Bacillus subtilis B237,GenBank登陆号分别为DQ010109和DQ517306。利用微生物降解TSNA在国内外的报道中还不多见,利用反硝化细菌菌悬液处理烟丝,反硝化细菌利用烟丝中的硝酸盐和亚硝酸盐诱导产生硝酸还原酶和亚硝酸还原酶,降解烟丝中硝酸盐和亚硝酸盐的含量,从而降低其中TSNA的含量。这种方法简单易行,费用低,作用产物挥发,对烟丝的质量影响很小,不会造成对烟丝的污染。B88、B237菌株是筛选出来具有较好反硝化作用的菌株,试验结果表明,菌株在好氧条件下不能降解TSNA,增加湿度能促进TSNA的合成。菌悬液只在微厌氧条件下才能起反硝化作用,

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 烟草中特有的亚硝胺
• 1.1 亚硝胺的毒性
• 1.2 TSNA 的类型，合成前体及形成途径
• 1.3 影响烟草TSNA 积累的主要因素
• 1.3.1 烟草遗传类型与TSNA
• 1.3.2 烟草组织与TSNA
• 1.3.3 栽培技术与烟草TSNA
• 1.3.4 烟叶采收调制与贮存陈化
• 1.3.5 微生物与TSNA
• 1.3.6 抗生素
• 1.4 降解烟草特有亚硝胺
• 2 硝酸还原与反硝化作用
• 2.1 同化型硝酸盐还原
• 2.1.1 植物NR
• 2.1.2 植物NR 的调节
• 2.1.3 Nicotiana spp NR 缺失
• 2.1.4 细菌NR
• 2.1.5 真菌NR
• 2.2 异化型硝酸还原
• 2.2.1 细菌异化型NR
• 2.2.2 真菌异化型NR
• 3 硝酸还原酶结构、功能和调节
• 3.1 结构特性
• 3.1.1 多肽序列
• 3.1.2 协作因子和金属离子
• 3.1.3 功能片断和区域
• 3.1.4 硝酸还原酶全酶的3-D 结构模型
• 3.2 功能特征
• 3.2.1 硝酸还原酶的催化反应及功能片段
• 3.2.2 功能性氨基酸残基
• 3.2.3 残基决定的吡啶核苷酸特异性
• 3.3 调节
• 3.3.1 调节的分子机制
• 3.3.2 NR 的磷酸化和被14-3-3 蛋白的抑制
• 4 实际应用
• 4.1 硝酸盐污染问题
• 4.2 硝酸还原酶作为环境生物技术工具
• 5 发展展望
• 6 本研究的目的意义
• 第二章 反硝化细菌的筛选及培养条件的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株及来源
• 1.1.2 培养基及制备
• 1.1.3 仪器与器材
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌株反硝化作用能力的测定
• 1.2.2 菌株适宜培养基及好气性测定
• 1.2.3 生长温度的测定
• 1.2.4 菌体浓度的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株反硝化作用强度的筛选
• 2.1.1 产气测定
• 2.1.2 菌株降解硝酸盐特性测定
• 2.2 培养基及好气性测定
• 2.3 生长温度测定
• 2.4 生长浓度的测定
• 3 结论与讨论
• 第三章 烟草特有亚硝胺的生物降解
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种及来源
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 仪器与器材
• 1.1.4 烟丝
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌株的培养
• 1.2.2 菌悬液降解TSNA 的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌悬液作用好气性及作用时间测定
• 2.2 菌悬液对烟丝质量的影响
• 3 讨论
• 第四章 反硝化细菌菌株888、8237 的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要仪器和试剂
• 1.1.4 试剂配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 DNA 的提取
• 1.2.2 16 SrDNA 片断PCR 扩增
• 1.2.3 PCR 产物回收
• 1.2.4 连接
• 1.2.5 转化
• 1.2.6 菌落PCR 鉴定
• 1.2.7 质粒提取
• 1.2.8 酶切鉴定
• 1.2.9 16S rDNA 序列测定
• 1.2.10 系统发育树的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 16S rDNA 片断PCR 扩增
• 2.2 16S rDNA 的序列
• 2.3 基于16 SrDNA 序列的分析
• 2.4 同源性分析
• 3 讨论
• 第五章 芽孢杆菌硝酸还原酶的纯化及特性
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要仪器和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 液体发酵培养
• 1.2.2 诱导底物浓度对硝酸还原酶产生的影响
• 1.2.3 不同培养时间对硝酸还原酶产生的影响
• 1.2.4 酶活力测定
• 1.2.5 蛋白质含量测定
• 1.2.6 Bacillus subtilis B88 硝酸还原酶的分离纯化
• 1.2.7 蛋白质分子量测定和纯度鉴定
• 1.2.8 活性电泳
• 1.2.9 硝酸还原酶酶学特性的研究
• 2 结果与分析
• 2.1 诱导底物浓度对硝酸还原酶产生的影响
• 2.2 不同培养时间对硝酸还原酶产生的影响
• 2.3 硝酸还原酶的分离纯化
• 2.3.1 DEAE-Sepharose 阴离子交换柱层析
• 2.3.2 Phenyl-Sepharose 疏水柱层析
• 2.3.3 Sephadex G-200 凝胶过滤层析
• 2.3.4 硝酸还原酶纯化过程总表
• 2.3.5 硝酸还原酶分子量和纯度鉴定
• 2.4 硝酸还原酶的特性研究
• 2.4.1 最适反应温度
• 2.4.2 最适反应pH 值
• 2.4.3 硝酸还原酶的热稳定性
• 2.4.4 硝酸还原酶的pH 稳定性
• 2.4.5 不同金属离子对硝酸还原酶活性的影响
• 3 讨论
• 3.1 Bacillus subtilis B88 硝酸还原酶的纯化方法
• 3.2 Bacillus subtilis B88 硝酸还原酶的特性
• 3.3 Bacillus subtilis B88 硝酸还原酶的应用和存在的问题
• 第六章 芽孢杆菌硝酸还原酶编码基因的克隆及其序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 菌株与质粒
• 1.1.3 酶和生化试剂
• 1.1.4 仪器
• 1.1.5 培养基
• 1.1.6 PCR 引物设计
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 DNA 的提取
• 1.2.2 各亚基PCR 扩增
• 1.2.3 PCR 产物回收
• 1.2.4 连接
• 1.2.5 转化
• 1.2.6 菌落PCR 鉴定
• 1.2.7 质粒提取
• 1.2.8 酶切鉴定
• 1.2.9 序列测定
• 1.2.10 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 亚基PCR 扩增
• 2.1.1 α亚基PCR 扩增
• 2.1.2 β亚基PCR 扩增
• 2.1.3 γ亚基PCR 扩增
• 2.1.4 δ亚基PCR 扩增
• 2.2 硝酸还原酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列
• 2.2.1 α亚基核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列
• 2.2.2 β亚基核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列
• 2.2.3 γ亚基核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列
• 2.2.4 δ亚基核苷酸序列及推测的相应氨基酸序列
• 2.3 硝酸还原酶基因氨基酸序列分析
• 2.3.1 α亚基氨基酸序列分析
• 2.3.2 β亚基氨基酸序列分析
• 2.3.3 γ亚基氨基酸序列分析
• 2.3.4 δ亚基氨基酸序列分析
• 2.4 硝酸还原酶基因的信号肽分析
• 3 讨论
• 第七章 结论和建议
• 1. 结论
• 2. 建议
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况