中性及Vc条件下，DNA加速氧化SOD1聚集及聚集体的HepG2细胞毒性研究

论文摘要

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种发病机理未知的较常见成人神经退行性疾病。铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)突变产生某种未知的获得性新功能被认为是导致ALS的原因之一,然而目前并不清楚SOD1在ALS发病过程中的作用。核酸作为贮存、传递遗传信息的物质,在生命活动中发挥极为重要的作用,轻微的损伤也会影响生物体的正常功能。由于目前已发现DNA损伤涉及某些神经退性行疾病,因此,本文从SOD1与DNA相互作用的角度,探讨SOD1的获得性新功能,取得如下主要结果:1.利用SOD1内源荧光猝灭实验,研究证实了Vc浓度及反应时间对SOD1内源荧光的影响,结果表明:随着Vc浓度的增加及反应时间的延长,SOD1内源荧光逐渐减弱;利用外源荧光染料染色的方法,研究证实了Vc浓度及反应时间对SOD1疏水性的影响:SOD1疏水性变化与Vc浓度及反应时间正相关。2.将正常SOD1暴露于中性及Vc环境下模拟金属结合区域SOD1突变体因突变导致的蛋白质稳定性降低、聚集倾向增强的性质,探讨了DNA加速修饰后SOD1聚集的机理。利用GeneGreen染色实验研究证实了SOD1对DNA有一定的亲和性,两者之间可能通过静电相互作用结合;利用直角光散射(RALS)、激光动态光散射(DLS)等系统研究了中性及Vc环境下DNA加速SOD1聚集的性质,结果表明在中性及Vc条件下,DNA可以作为模板加速SOD1形成聚集体,且聚集体的大小与DNA浓度、SOD1浓度、反应时间正相关。由Vc与DNA相互作用导致的SOD1疏水性增强和DNA的模板富集效应是SOD1聚集的两个决定性因素。3.利用透射电镜(TEM)研究了中性及Vc条件下DNA加速SOD1形成的聚集体形态。Vc浓度、SOD1与DNA比例及反应时间不同,疏水性增强的SOD1可形成不同类型的聚集体。在SOD1与DNA的比例一定的条件下,反应时间越长,聚集体的紧密程度越大,形态越稳定。4.培养HepG2细胞,并与不同条件下(Vc浓度系列、反应时间系列)获得的不同形态的聚集体共培养,运用MTT法测定共培养后细胞活力,结果发现在实验设定的条件下Vc浓度越大、反应时间越长细胞活力越小,即Vc浓度越大、反应时间越长、聚集体越大细胞毒性越大。从而建立了Vc浓度、反应时间、聚集体大小与细胞毒性之间的相关性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 SOD1 的结构特征与基本性质
• 1.3 SOD1 和肌萎缩侧索硬化症
• 1.4 FALS 相关SOD1 突变部位
• 1.5 SOD1 突变体体外性质研究
• 1.6 SOD1 的细胞毒性作用模型
• 1.7 本论文研究目的
• 2 中性条件下VC 对SOD1 疏水性的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 3 中性及VC 条件下，DNA 加速氧化修饰的SOD1 聚集
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 4 中性及VC 条件下， SOD1 聚集体形貌研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 5 中性及VC 条件下， SOD1 聚集体细胞毒性研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.3 结果
• 5.4 讨论
• 6 全文总结
• 6.1 主要研究结果
• 6.2 本文创新之处
• 致谢
• 参考文献