论文摘要
马铃薯（Solanum tuberosum）属茄科茄属植物,起源于南美洲安第斯山脉一带,是世界上仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物,在世界粮食安全体系中具有重要作用。由致病疫霉菌（Phytophthora infestans（Mont.）de Bary.）引起的晩疫病是马铃薯世界范围内最具毁灭性的病害,每年引起数十亿美元的损失,我国每年因晩疫病造成的减产损失在10亿美元以上。因为P. infestans存在有性和无性两种生殖方式,具有极高的进化潜力,通过常规育种导入到栽培种中的抗性R基因很容易被克服。现在,通过生物工程手段构建抗病基因近等混合系成为持久防控晚疫病的最有希望的策略之一,然而这种策略需要克隆多个晚疫病抗性基因。本研究旨在通过对马铃薯晚疫病主效抗性基因R10和R11分离群体的遗传分析和基因定位,初步揭示马铃薯11号染色体抗晚疫病主效位点（MLB）的基因组成和遗传特性,为进一步的基因克隆和了解马铃薯野生群体的晚疫病抗性机制并最终持久地防控马铃薯晚疫病奠定基础。本研究的主要结果如下:1.通过对R10基因分离群体的遗传分析和作图表明,主效基因和抗性QTLs共同决定了R10的晚疫病抗性。马铃薯晚疫病抗性基因R10抗谱广,应用价值大,常用于马铃薯抗病杂交育种。利用三个不同小种但含有同一个无毒基因Avr10的晚疫病菌株分别对R10分离群体进行离体叶片接种,结果表明分离群体对这三个菌株表现出不同的抗病反应。其中针对菌株IPO-0或99018的抗性是由QTLs控制的数量性状,而针对菌株89148-9的抗性是由主效基因即R10控制的。统计学分析表明,针对菌株IPO-0或99018的抗性QTLs与位于马铃薯11号染色体末端的R10位点连锁。所以,抗晚疫病主效基因R10与抗性QTLs成簇存在很可能是R10鉴别寄主良好田间抗性的原因。2.利用比较基因组学结合BSA分析方法定位了马铃薯抗晚疫病主效基因R10,并构建了R10位点的高分辨率遗传图谱。R10位点位于马铃薯11号染色体的短臂末端,与已克隆的晚疫病抗性基因R3a同属于抗晚疫病主效位点的单倍型（haplotypes）。应用比较基因组学和BSA分析,开发了6个与R10连锁的分子标记,并将R10初步定位在1001T和C2At5g59960两个遗传距离为2.6 cM分子标记之间。R10位于已克隆的晚疫病抗性基因R3a的近端粒区。利用R10位点的两侧标记,从1942株R10分离群体中筛选到99株R10位点重组单株,对其进行已开发标记分析和接种鉴定,从而构建了R10位点的高分辨率遗传图谱。R10基因被定位于标记656T和1001T之间的0.26 cM的遗传区间内,为抗晚疫病分子标记辅助育种和R10基因的最终克隆打下了基础。3.通过马铃薯MLB位点比较作图,定位了马铃薯抗晚疫病主效基因R11。以晚疫病抗性基因R11的鉴别寄主MaR11和不含已知抗性基因的品种Katahdin为杂交亲本的F1群体为杂交亲本,对包含83个基因型的R11基因的分离群体进行了晚疫病菌株接种和遗传分析,确定R11为主效单基因,在MaR11中以单式（simplex）存在。应用比较作图和BSA分析,开发了6个与R11连锁的分子标记,并将R11定位在11号染色体末端,距离最近的C2At5g59960标记遗传距离约为2.4 cM。R11较晚疫病抗性基因R3a和R10更靠近近端粒区。本研究所获得的遗传图谱为进一步构建R11高分辨率遗传图谱提供了基础。4.建立了从马铃薯BAC文库中快速富集抗病基因及其同源序列的磁珠分离系统。我们首先根据晚疫病抗性基因R3a家族的序列比对结果设计了R3a基因家族的保守探针,并将含有R3a基因的BAC SH23G23部分酶切成7-11 kb DNA片段。通过结合保守探针的磁珠系统对上述7-11kb DNA片段进行R3a基因分离,将磁珠富集到的片段克隆到双元载体pBINPLUS上。通过阳性克隆和菌落PCR鉴定表明,含有R3a基因的克隆比率达到82.76%,相对于磁珠系统富集前,R3a基因比率提高近19倍。传统的基因克隆方式,图位克隆和转座子标签法,在遵循同源四倍体的四体遗传规律的栽培马铃薯中应用难度极大,而本研究建立了抗病基因及其同源序列的磁珠分离系统,为利用同源基因法克隆马铃薯四倍体栽培种中基因提供了实验基础。